白三烯受体阻滞剂对大鼠哮喘模型肺部损害作用的实验研究

戴吉成 毕文术 都玉敏 刁甜甜 任明永

过敏性慢反应物质白三烯(leukotriene；LTs)已被确认在支气管哮喘发病中起较重要的作用[1]。LTs受体在人体和大鼠体内有二种，一种为半胱氨酰白三烯(cysteine leukotriene；Cys-LTs)受体，另一种为白三烯B4(leukotriene B4；LTB4)受体。Cys-LTs受体在肺支气管平滑肌和巨噬细胞中有较强的表达，主要引起嗜酸细胞及淋巴细胞、单核细胞聚集并释放淋巴因子，在肺气管黏膜壁上大量聚集从而引起支气管平滑肌痉挛。LTB4在肺组织中也有较强的表达，可引起中性粒细胞的趋化并聚集，产生支气管黏膜壁的炎症反应，从而使支气管黏膜壁通透性增加，气道分泌物增多。也有文献报道称可能有第三种或更多的受体亚类。目前，阻断Cys-LTs受体的药物主要为孟鲁司特，而阻断LTB4受体的阻滞剂还在研究阶段。本实验利用大鼠哮喘模型，观察LTs受体表达后对肺脏的损害，以及阻滞LTs受体对肺部的影响。

材料和方法

1. 实验材料:健康大鼠30只，雌雄不限，体重180～250 g，由哈尔滨医科大学动物实验中心提供，卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)购自美国Sigma公司，孟鲁司特购自美国默沙东公司，雾化泵经由葛兰素公司提供。

2. 哮喘模型的建立：将30只大鼠分为空白对照组8只，哮喘模型组22只。参照近期报道的办法[2-4]，哮喘模型组在第0、7天，每只大鼠分别在腹腔内注射抗原混悬液(OVA1 mg、溶解于含10%氢氧化铝的无菌生理盐水0.5 ml配成混悬液)致敏。从第14天开始雾化1% OVA进行哮喘激发，每天1次，每次20 min。大鼠致敏激发后，即刻表现为呼吸急促，节律不规则，行动迟缓，严重者大小便失禁；连续激发表现为发音迟钝、竖毛、毛色失去光泽。在大鼠哮喘模型中挑选喘息症状最为明显者16只，再分成哮喘组和孟鲁司特组，每组各8只。其中孟鲁司特组在雾化第2天开始口服孟鲁司特(4毫克/日)。空白对照组均用无菌生理盐水代替。

3. 组织标本制备、留取支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavage fluid；BALF)：末次雾化激发后24 h麻醉大鼠，打开胸腔，暴露两肺，观察大体标本；然后经气管插管以无菌生理盐水3 ml进行全肺灌洗，重复3次后收集BALF作细胞学分类及淋巴细胞凋亡分析；以止血钳夹闭右支气管，切除右肺中叶用10%中性缓冲甲醛固定，留用组织病理学检查。

4. 组织病理切片制备：常规石蜡包埋切片，HE染色后，留取观察肺组织病理改变。

5. 细胞培养与白细胞计数：(1)将10×Binding buffer工作液加入无菌去离子水稀释成1×Binding buffer工作液。(2) 对于悬浮细胞，500～1 000 g离心5 min收集细胞。对于贴壁细胞，要用不含EDTA的胰酶消化细胞，加入细胞培养液。将细胞轻轻吹打下来，转移到离心管内，500～1 000 g离心5 min收集细胞。(3)收集细胞后，加入预冷PBS溶液后轻摇或移液器轻柔吹打洗涤，离心收集细胞，共洗涤两次。(4) 在细胞沉淀中加入1×Binding buffer工作液，重悬细胞，使细胞浓度达到1×106cell/ml。(5) 吸取100 μl细胞悬液至一新管中，加入5 μl Annexin V-FITC和5～10 μl PI，轻轻混匀，室温避光孵育15 min。(6)流式细胞仪检测。染色孵育后，每管加入400 μl的 1×Binding buffer工作液，混匀后使用流式细胞仪检测(1 h内检测)。

6. 填加孟鲁司特后淋巴细胞凋亡率的对比观察：取对照组和哮喘组的细胞培养液各分成两个亚组，一亚组在细胞培养液加入孟鲁司特；另一亚组不加。37℃、5% CO2环境下培养20 h后进行淋巴细胞凋亡观察。

结果

1. LTB4受体表达而Cys-LTs受体被阻断后对哮喘气道BALF细胞学的影响:哮喘组及孟鲁司特组，BALF中白细胞总数均明显高于对照组，其中哮喘组嗜酸粒细胞及淋巴细胞总数均明显高于孟鲁司特组。见表1。

2. LTB4受体表达，而Cys-LTs受体被阻滞后，对哮喘大鼠肺病理组织的影响:由图1可看出，对照组肺外观粉红，未见有异常充血表现；而另外两组，肺外观暗红，有充血、出血点表现。HE染色可见，哮喘组的肺病理切片显示，支气管黏膜下及肺泡间隔有大量炎症细胞浸润，以嗜酸粒细胞(EOS)、淋巴、单核细胞浸润为主，支气管上皮肿胀部分黏膜脱落，支气管平滑机增厚。孟鲁司特组EOS、淋巴、单核细胞浸润比哮喘组明显减少，但仍可见中性粒细胞大量浸润，支气管上皮肿胀，痰栓及大量分泌物，气道破坏肿胀改变。

3. 淋巴细胞凋亡的观察:将对照组、哮喘组，留取BALF细胞培养液，每组均分两份(即2个亚组)。一个亚组加孟鲁司特，另一亚组不加孟鲁司特。培养20 h后，观察淋巴细胞的凋亡情况。结果显示，加入孟鲁司特后，哮喘组淋巴细胞凋亡率增高明显 (P<0.01)，而对照组加药前后淋巴细胞凋亡率变化不明显。见表2。

讨论

早在二十世纪三十年代发现的过敏性慢反应物质，现已被确认为是一种重要的脂质前炎症介质。它是一种二十碳不饱和脂肪酸。由于其最初来源于白细胞，并且碳链中含有三个不饱和双键，故称为LTs。它在哮喘发作中起重要的作用，引起平滑肌痉挛，产生哮喘，是组胺的1 000倍。它主要分为两类，一类是具有强烈的化学趋化活性的LTB4，一类为Cys-LTs[5-6]。作用于受体后LTB4主要对中性粒细胞具有较强趋化功能，而Cys-LTs主要对嗜酸性粒细胞淋巴细胞有强趋化作用。目前，在支气管哮喘中，LTs的作用逐渐被认识，LTs受体阻断剂在临床的使用越来越广泛，其中Cys-LTs受体拮抗剂孟鲁司特在临床中广泛应用，并取得了肯定的效果[7-10]。Cys-LTs受体阻滞剂在预防支气管哮喘中，有以下几方面作用：(1)抑制炎症细胞的聚集和增殖，同时也诱导炎症细胞凋亡，作用于嗜酸性粒细胞、淋巴细胞等炎症细胞；(2)对细胞因子及炎症介质释放的影响，降低气道高反应性。另有报道，LTB4受体阻滞剂，可以抑制中性粒细胞聚集，降低毛细血管通透性和减少腺体黏液分泌，另外有抑制气道重塑，抗肺纤维化作用。但在临床中，孟鲁司特单以Cys-LTs受体拮抗剂为主，不能使中性粒细胞产生的炎症反应得以很好的控制，造成哮喘的恢复期时间长及炎症渗出消退的时间缓慢。目前LTB4受体阻滞剂还未应用到临床，其作用国内少有报道。

本实验结果显示，孟鲁司特组哮喘大鼠嗜酸粒细胞及淋巴细胞总数比哮喘组明显减少，而中性粒细胞总数无减少，这与Lee等[11-12]和Tenero等[13]研究报告相一致。与对照组相比，中性粒细胞总数确有显著的增加。从病理结果来看，孟鲁司特组淋巴细胞浸润明显比哮喘组细胞减少，但气道内渗出物，痰栓却无明显变化，气道黏膜仍有肿胀，破坏的表现。因此，单纯的应用孟鲁司特后气管炎症的损坏不能很快消除，中性粒细胞浸润，不能完好的得到控制，所以有气管痰栓、分泌物存留，甚至出现黏膜肿胀断裂。这与拮抗Cys-LTs受体后，LTB4受体继续表达有密切相关。哮喘组和对照组两组大鼠BALF淋巴细胞培养20 h观察淋巴细胞的凋亡情况，结果显示，加入孟鲁司特后，哮喘组淋巴细胞凋亡率增高明显 (P<0.01) ，而对照组是否加药淋巴细胞凋亡率无明显差别。提示孟鲁司特对BALF淋巴细胞的凋亡起促进作用[14-15]。从结果分析来看，Cys-LTs受体拮抗剂孟鲁司特对大鼠哮喘模型活化淋巴细胞产生有效的抑制，加快淋巴细胞的凋亡，降低了炎症反应，也会缩短气道高反应的持续时间。

表1 三组大鼠BALF中白细胞计数

注：与对照组比较，*P<0.05；与孟鲁司特组比较，▲P<0.05

表2 两组大鼠细胞BALF培养液加与不加孟鲁司特淋巴细胞凋亡率的比较

注：与对照组比较，*P<0.05

本实验显示Cys-LTs被阻断后，嗜酸粒细胞和淋巴细胞、浸润明显减少，提示Cys-LTs受体拮抗剂可以减少哮喘中重要介质的浸润，在哮喘中起到明显的控制作用。然而怎样迅速减轻气道炎症的破坏，哮喘发作后减轻气管炎症的刺激，迅速恢复炎症的改变，也是控制哮喘反复发作关键。LTB4受体拮抗剂是否会抑制中性粒细胞浸润，防止气管黏膜损坏，是将来研究的重要方向。Cys-LTs受体与LTB4受体拮抗剂的联合应用，效果可能会更好。这都有待于今后进一步的研究解决。

图1 哮喘大鼠肺病理组织HE染色