GC-MS/MS法测定蚕蛹中35种农药残留含量

李海印 姜 涛 高尧华 宋卫得 刘 冰

（日照海关 山东日照 276826）

1 前言

随着农业科技的发展及其应用的加强，人们对营养和健康的认识也随之提高，蚕蛹的营养价值也引起了人们的广泛关注。近年来，科研工作者就蚕蛹的成分在食品行业、饲料制造、化工行业、医药等不同领域的应用进行了深入的研究[1-8]。目前，蚕蛹蛋白粉的深加工、蚕蛹水解氨基酸、蚕蛹壳聚糖在食品工业领域的研究成果得到应用。此外，蚕蛹还可用作蛹虫草培育的优良寄主[9-14]。随着蚕蛹食用价值的不断开发，对蚕蛹食品质量控制变得愈加重要。长期以来，为使农作物高产增收，农产品在种植过程中使用了大量的农药，有些农药难以降解，污染二次种植及相关食物链产物，因此蚕蛹及其制品作为食品，在其流入市场之前有必要对其农药残留含量进行安全检测。关于蚕蛹及其制品中农药残留含量的检测方法，目前国内关注者甚少。

本研究基于蚕蛹中油脂含量高，基质相对复杂等特点建立了一种蚕蛹中农药残留含量的检测方法。该方法可有效去除共提取干扰物，提高检测准确度，同时操作简单，灵敏度高，重现性好，可广泛应用于蚕蛹及其制品中多种农药残留含量的检测。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

气相色谱/串联三重四级杆质谱仪（Agilent 7890-7000BGC-MS/MS）；均质器；KS260 振荡器（德国 IKA）；Turbo Vap型氮气吹干仪（美国Zymark公司）；T40离心机（上海安亭）；Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）；PSA/C18 SPE 固相萃取柱（1 000 mg，6 mL，艾洁尔）。

乙腈、丙酮、正己烷、乙酸乙酯均为色谱纯；35种农药化合物为农业部有证标准物质（质量浓度均为100 μg/mL）；溶剂：丙酮+正己烷（体积比为 5∶5）；无水氯化钠、氢氧化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾为分析纯；实验用水为超纯水。

2.2 实验方法

2.2.1 溶液配制

分别准确量取各标准品（中国农业部，纯度≥99%），用正己烷配制成10 mg/L的单品种标准储备液，使用时根据需要用正己烷稀释配成不同浓度的工作液。

4%氢氧化钠溶液：4 g氢氧化钠溶解于水中，定容于100 mL容量瓶中。

0.5 mol/L磷酸盐缓冲溶液（磷酸二氢钾∶磷酸氢二钾=1∶1）：34.02 g磷酸二氢钾和 57.06 g磷酸氢二钾溶于水中，用4%氢氧化钠溶液调节pH为7，定容于500 mL容量瓶中。

2.2.2 样品前处理

称取10.00g蚕蛹试样（精确至0.02g），置于50mL离心管中，加入20 mL乙腈均质提取2 min，加入5 g氯化钠，10 mL磷酸盐缓冲溶液，振荡20 min，冷冻30 min后以5 000 r/min离心5 min，取上清液10 mL，氮气吹至近干，加入2 mL 1∶1丙酮+正己烷溶液，待净化。

将浓缩液加入1∶1丙酮+正己烷淋洗过的PSA/C18固相萃取柱中，用2 mL 1∶1丙酮+正己烷溶液冲洗样品管2次，2次清洗液均过固相萃取柱，用10 mL 1∶1丙酮+正己烷溶液洗脱，收集洗脱液置于氮吹管中，氮气吹至近干，用少量1∶1丙酮+正己烷溶液多次溶解残渣于刻度玻璃管中，定容至1.0mL，上机分析。

2.2.3 气相色谱/串联三重四级杆质谱仪（GC-MS/MS）条件

色谱柱：HP-5MSUI（30 m×0.25 mm，0.25 μm）弹性石英毛细管柱；载气：高纯氦气（99.999%）；碰撞气：高纯氮（99.999%）；流速：1.1 mL/min；进样方式：不分流进样；进样量：1.0 μL；柱温：初始 70℃（2 min），以25℃/min程序升温至150℃，再以3℃/min程序升温至200℃，8℃/min程序升温至280℃；辅助加热温度：280℃；溶剂延迟5 min；进样口温度：280℃。离子源：EI源；离子源温度：260℃；扫描方式：多反应监测模式（Multiple Reaction Monitoring，MRM）。

3 结果与讨论

3.1 提取溶剂的选择

农药类化合物可溶于正己烷、乙酸乙酯、乙腈、加入磷酸盐缓冲溶液的乙腈、加入醋酸缓冲溶液的乙腈等多种有机试剂，农药残留提取方式有超声波提取、均质提取及振荡提取等多种提取方法。经实验，蚕蛹类样品通过先均质提取后再进行振荡提取回收率明显提高。在农药残留提取过程中，选择正己烷和乙酸乙酯作为农药残留提取溶剂，在浓缩过程采用氮气吹干后油脂难以有效去除，不易净化，且回收率不理想。加入醋酸缓冲溶液的乙腈作为提取溶剂，在实验过程中部分农药残留易降解，回收率低。以回收率最低组分为例，其对比结果详见表1。

表1 多种提取溶剂对检测回收率的影响

同时本实验也对磷酸盐缓冲溶液的浓度进行了对比，其对比结果详见表2。

正己烷、乙酸乙酯、乙腈可以溶解大部分农药类化合物，但在提取过程中，蚕蛹油脂及蛋白质含量高、成分复杂，普通溶剂提取的回收率低，油脂含量高，而加入磷酸盐缓冲溶液的乙腈作为提取液回收率可以提高18.4%～39.2%，因此，经过实验最终确定加入0.5 mol/L磷酸缓冲溶液的乙腈为提取溶液， 采取均质加振荡的提取方式。样品提取完毕后，实验对比冷冻与不冷冻条件下油脂去除效果，发现冷冻后取上层溶液，经氮气吹干后无明显油脂，进样后共提取物干扰峰降低，实验最终确定提取后增加冷冻步骤。

表2 多浓度缓冲溶液对检测回收率的影响

3.2 净化方式的选择

蚕蛹类产品为高油脂、高蛋白样品，在色谱检测过程中共提取物油脂峰干扰目标分析物检测，不但影响定量结果的准确性，且损害色谱柱。本文对几种常用的农药残留净化方式进行对比实验。对比结果详见图1。

现如今，常用的样品前处理的净化方式主要有QuEchERS方法以及最新报道的增强型脂质去除（EMR）提取净化法，本文将各种方法净化效果进行对比发现，采取本文所述方法净化效果最佳。同时对固相萃取柱的净化效果进行对比，选择弗罗里硅土柱、固相萃取柱、氨基柱与PSA/C18柱对比实验表明，经PSA/C18柱净化后共提取物减少，可以有效去除干扰，灵敏度和准确性均提高。研究表明蚕蛹样品不同于植物源性油脂样品，在QuEchERS方法中，C18和PSA的固体颗粒难以有效吸附油脂，净化效果不理想。蚕蛹中油脂与肉、鱼等样品对比，其油脂含量低，油脂分子结构也有所不同，因而在油脂去除过程中过单PSA/C18固相萃取柱即可有效净化。

图1 不同净化方式净化后对比色谱图

3.3 浓缩方式的选择

对旋转蒸发和氮气吹干2种不同浓缩方式进行实验，采用将标准溶液在旋转蒸发和氮气吹干2种条件下浓缩上机检测，结果表明，乙酰甲胺磷、溴氰菊酯通过旋转蒸发浓缩，其回收率较氮气吹干浓缩方式降低11.5%～26.0%，实验选择氮气吹干的浓缩方法，将净化溶液吹至无明显液滴流动即可。

3.4 GC-MS/MS条件的选择

35种农药类化合物沸点及分离温度各不相同，在检测过程中采用程序升温，提高各物质的分离度，有效改善峰形。将单一标准品全扫描（SCAN）模式扫描，通过色谱峰的出峰时间确定每种化合物的保留时间（图 2）。

图2 溶剂标准溶液(0.10 μg/mL)在MRM模式下的总离子流图

从每种化合物的一级质谱图中选择母离子碎片，通过选择不同碰撞能量对母离子进行碰撞解离，进而选择子离子，并确定离子对的最佳碰撞能量，建立多反应监测（MRM）模式下定性、定量分析方法。该方法可有效提高各类化合物的灵敏度和分离度，使35种化合物检测低限均可达到0.01mg/kg。

3.5 方法线性关系与检出限

经实验，样品净化后基质对目标物的准确性无明显影响。用丙酮-正己烷（体积比1∶1），配制35种农药基质标准溶液，浓度为0.050 mg/L，0.10 mg/L，0.20 mg/L，0.50 mg/L，1.0 mg/L。 以每种农药化合物定量离子的峰面积y和相应的质量浓度x（mg/L）为横、纵坐标绘制标准曲线，得到该化合物线性方程与线性相关系数，35种化合物其线性系数均大于0.99，表明35种农药类化合物在该方法检测中具有良好的线性关系。通过检测空白样品的3倍信噪比确定该方法的检出限，检测空白样品的10倍信噪比确定该方法的定量限，蚕蛹中35种农药化合物的检出限为0.001～0.005 mg/kg，可满足我国对蚕蛹中农药残留的监控要求。

3.6 方法的回收率与精密度

选取空白蚕蛹产品，分别添加10μg/kg，20μg/kg，100 μg/kg的标准溶液后，按上述前处理方法对回收率和精密度进行测试，3个不同浓度水平每个重复测定6次，实验结果详见表3。

表3 蚕蛹样品中35种农药残留回收率和精密度试验结果(n=6)

续表3

由表3可知，35种待测化合物的添加回收率为76.7%～105.3%，相对标准偏差为1.36%～9.7%。该方法的准确度及精密度大于EMR方法所述回收率为50%，也高于普通QuEchERS方法回收率，净化效果更理想。经实验测定，QuEchERS和EMR前处理方式在提取和净化过程中大量放热，部分农药类化合物遇热易分解，这使得该类化合物在前处理过程中被吸附和降解从而导致回收率低。本方法净化效果好，灵敏度高，精密度和准确度均满足方法学指标，适用于蚕蛹中的农残检测。

按上述实验方法对10批次蚕蛹样品中35种农药类化合物进行测定分析，考察各化学成分的准确度和精密度。结果表明，各化学成分精密度和准确度均可满足国标方法学中该类农药残留检测的要求，较其他方法回收率和精密度均有提高。

4 结论

本研究建立了蚕蛹中35种农药残留含量的气相色谱/串联三重四级杆质谱检测方法。本方法选用乙腈加磷酸缓冲溶液作为提取，PSA/C18复合固相萃取柱净化，配制基质标准溶液进行定量分析，该方法可以对蚕蛹中35种农药残留含量进行准确的定量分析，具有回收率和精密度良好，前处理操作简单快速、成本低等优点，各项技术指标均能满足蚕蛹类产品农药残留含量检测分析的技术需求。