伤科凝胶剂提取工艺研究

侯影，张旭

1.辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032；2.辽宁中医药大学，辽宁 大连 116600

伤科凝胶剂是根据多年临床经验方，采用现代制药技术开发研制成的外用制剂。伤科凝胶剂处方由红花、马钱子、三七、续断等十味中药组成，根据药材性质及临床需要，经实验选择的剂型为凝胶剂，以卡波姆-940为基质加工制成。具有止痛消肿、化瘀活血的作用，主要用于瘀血肿痛、跌打损伤等症。近年来凝胶剂是为满足临床需要而发展起来的一种新的药物剂型，目前国内外研究开发已很广泛且日渐成熟。常用基质有卡波姆(Carbomer，CBM)、羟甲基纤维素钠、泊洛沙姆(poloxmner)、甲壳胺、琼脂、壳聚糖等。凝胶剂基质可以应用卡波姆-940，具有制备工艺简单、稳定性优异、对皮肤无刺激性、外观细腻、无油腻、滑爽、干后易清洗等特点，是优良的外用剂型。凝胶剂自身具有液体和固体的双重特性，从收缩率、导电性、蒸气压等方面，可以被看作为液体；从结构上，高浓度凝胶所具有的物质状态，又可以看作是固体。凝胶剂作为一种透皮吸收好、无油腻感、涂展性好、易于清洗的新外用剂型，可广泛用于控释制剂、缓释制剂及脉冲释放等新型给药途径，适用于皮肤、黏膜、腔道。传承内病外治的治疗理念，既可以避免口服药经过酶、酸等作用在胃肠道内产生首过效应，且可以降低药物自身的毒副作用，凝胶剂作为外用制剂已成为近几年来局部用药的热点研究方向。

方中马钱子为马钱子科马钱Strychnosnux-vomicaL.的成熟种子，始见于《本草纲目》[1]。其性温，味苦，有大毒，主要归脾、肝经；具有消肿散结，通络止痛之效。临床治疗风湿顽痹、跌打损伤、麻木瘫痪、咽喉肿痛、痈疽疮毒、骨折肿痛等方面具有显著疗效[2]。士的宁为马钱子主要含有的生物碱的单体成分，它既是有效成分，也是有毒成分，中毒剂量与治疗剂量相当，口服30～100 mg可以达到致死量[3]，曾有临床报道，1名69岁男性血样中含有0.29 mg·L-1士的宁导致死亡[4]。选择士的宁为实验考察的指标，为判定处方中药品质量的实物标准，进而保证药品的质量[5]。本实验采用正交试验设计法，以士的宁提取量为考察指标对凝胶剂的提取工艺进行研究。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1100高效液相色谱仪；微量进样器(规格：25 μL，Hamilton 美国)；数控超声波清洗器(型号：KQ-250DB，昆山市超声仪器有限公司)；旋转蒸发仪(型号：RE-52，上海亚荣生化仪器厂)；电子天平(型号：FA1004B，上海精密科学仪器有限公司)；十万分之一分析天平(型号：METTLER AE240，瑞士METTLER)；酸度计(型号：PHS-2C，上海伟业仪器厂)；低速大容量多管离心机(型号：LXJ-IIB，上海安亭科学仪器厂)；高速粉碎机(温岭市大德中药机械有限公司)。

1.2 试药

马钱子、三七等处方中药均由大连美罗中药厂有限公司提供。经辽宁中医药大学药学院翟延君教授鉴定为正品。

士的宁对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110706-200505)；乙腈、甲醇(色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)；庚烷磺酸钠(上海如吉生物科技发展有限公司)；磷酸(天津市大茂化学试剂厂)；磷酸二氢钾(天津市大茂化学试剂厂)；乙醇为分析纯；水为二次蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

硅胶柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶，柱温：室温。流动相：乙腈-磷酸二氢钾(0.02 mol·L-1)与庚烷磺酸钠(0.01 mol·L-1)等量混合的溶液(pH值为2.8，用10%磷酸调节)(21∶79)。检测波长：254 nm，测定时间：60 min。

2.2 对照品溶液制备

精密称定士的宁对照品，置于容量瓶，用甲醇溶解，稀释至刻度线，制成每1 mL含0.004 mg储备溶液，即为对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备

称取1/4处方量马钱子、红花、三七、续断等十味中药共9份，每份质量为66 g。按照表2进行正交试验，采用加热回流提取的方法，得乙醇提取液，量取提取液体积，取正交设计的9份提取液，每份提取液记录体积，滤过，精密吸取续滤液2 mL，加入到容量瓶(10 mL)中，加入甲醇溶液进行稀释，至标准刻度，混合均匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，得到的续滤液，作为供试品溶液。

2.4 阴性供试品溶液制备

取除去马钱子以外的其他中药，按优选出的提取工艺提取制备阴性供试品，再参照2.3项下方法制备，备用。

2.5 线性范围考察

分别精密吸取士的宁对照品溶液(0.004 012 mg·mL-1)2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 μL，注入液相色谱器仪中，测定色谱峰的峰面积，分别以进样量为横坐标(X)、色谱峰面积为纵坐标(Y)，绘出对照品溶液标准曲线图，得到回归方程为：Y=1 797.5X-1.133 3，r=0.999 9。士的宁进样量在0.010 03～0.060 18 μg线性关良好。

2.6 精密度试验

精密吸取士的宁对照品溶液10 μL，重复6次进样，测定士的宁的峰面积。士的宁RSD为0.14%，显示该方法精密度良好。

2.7 重复性试验

取同一批样品6份，分别精密称定，按上述2.1项下的色谱条件和2.3项下供试品溶液制备方法进行测定含量，结果士的宁RSD为0.98%，显示此方法重复性良好。

2.8 稳定性试验

选取0、4、8、12、16、20、24 h进样取同一2.3项下供试品溶液进行分析。结果表明：士的宁RSD为0.76%。说明在制备后24 h内供试品溶液的稳定性良好。

2.9 回收率试验

同一批样品(已知士的宁含量)精密称取0.1 g，依次精密加入一定量的士的宁对照品溶液，按2.3项下的方法操作，同时制备6份，按上述2.1项下色谱条件进行含量测定，计算样品回收率，士的宁平均回收率为99.75%，RSD为1.19%。

2.10 正交试验法

2.10.1供试品溶液的含量测定 各精密吸取10 μL供试品溶液、混合对照品溶液，测定士的宁含量，并计算士的宁提取量。士的宁对照品、士的宁正交提取9#供试品、阴性供试品溶液的色谱图见图1～3。

图1 士的宁对照品HPLC图

图2 9#伤科凝胶剂供试品溶液HPLC图

图3 缺的士宁的阴性供试品溶液HPLC图

2.10.2因素水平的确定与考察指标 方中马钱子主要含有的化学物质有马钱子碱、士的宁、豆甾醇苷、脂肪油、番木鳖苷、棕榈酸及绿原酸等[6]。其中，生物碱既为其主要有效成分又为其毒性成分。王雪等[7]的研究结果表明，马钱子碱和士的宁都是具有强烈毒性的物质，其中马钱子碱的毒性是士的宁毒性的20 倍；相关研究[8-9]表明，口服 5～10 mg 士的宁可出现中毒症状，口服30 mg 左右可导致死亡。而在使用一定量的马钱子后不仅能导致药源性损伤，还能损害肾小管上皮细胞，继而诱发肾功能衰竭和尿毒症等。依据本方中各中药化学成分的性质，在乙醇中有较好的溶解度，故选择回流提取的方法。在单因素考察的基础上，以乙醇溶媒浓度(A)、溶媒量(B)、提取时间(C)、提取次数(D)为考察因素，以士的宁提取量和浸膏收率为指标，试验按照L9(34)正交表进行，提取工艺优选因素水平见表1。

表1 伤科凝胶剂提取工艺因素水平

2.10.3正交试验 称取1/4处方量马钱子、红花、三七、续断等十味中药共9份，每份质量为66 g。依据正交试验表2进行实验，进行回流提取，得乙醇提取液，量取提取液体积，测定提取液中士的宁含量，并计算士的宁提取量。以浸膏收率综合评分加权值为0.5，士的宁提取总量综合评分加权值为0.5，两者之和为综合评分，作为考察指标，结果见表2。方差分析见表3。

表2 伤科凝胶剂提取工艺正交表L9(34)试验设计及结果

表3 伤科凝胶剂提取工艺方差分析表

注：F0.05(2，2)=19.00。

2.11 实验结果

从方差分析结果看出，各因素影响均不显著。本实验的影响因素主次顺序为D>A>C>B，经综合分析，确定其最佳提取工艺条件为A2B1C2D3。即以60%乙醇为溶媒，提取3次，溶媒为 10、8、8倍量，每次1.5 h。

2.12 验证实验

称取1/4处方量的处方中药3份，以10、8、8倍60%乙醇加热回流提取3次，每次1.5 h，合并提取液。得乙醇提取液，量取提取液体积，测定提取液中士的宁含量，并计算士的宁提取量，结果见表4。

表4 伤科凝胶剂提取工艺验证实验结果

根据验证结果，士的宁提取量和浸膏收率均略高于正交设计试验中的考察指标最高提取量，说明优选的提取工艺合理可行。

3 讨论

马钱子主要用于治疗类风湿关节炎、风湿关节炎、骨质增生、坐骨神经痛、痛风、骨关节炎、腰肌劳损等疾病，是痹症治疗的主要药物，临床上具有较高的应用价值[10-11]。马钱子有效成分主要为总生物碱，其中70%～80%为马钱子碱和士的宁，主要作用于心血管系统、中枢系统、免疫系统[12]。研究表明，马钱子碱(称布鲁生)和士的宁(番木鳖碱) 又是马钱子的主要毒性成分。其作用机理为对脊髓后角细胞具有高度的选择性兴奋作用，进而使脊髓的运动性反射作用增强，促使感觉器官的敏感性增强，主要作用为延髓血管运动中枢及呼吸中枢的兴奋、骨骼肌的紧张度增强，进而使大脑皮质感觉中枢的机能得到提高[13]，表现为强直性的惊厥，因而产生呼吸肌的抑制而致死。作为竞争性抑制甘氨酸受体的士的宁，可以阻断激活的甘氨酸受体，过度兴奋齿状回神经元使其产生惊厥。同时还具有阻止乙酰胆碱被胆碱酯酶破坏的作用，进而促进胃肠的蠕动，产生腹痛泻痢。另外，马钱子具有损害肾小管的上皮细胞的作用，进而破坏氨基酸代谢、脂质的代谢和糖酵解的过程，长期使用可损害人体肝肾功能[14]。临床目前应用的马钱子多作为复方制剂，用于镇痛、抗炎作用多为马钱子有效成分及其单方外用制剂。

凝胶膏剂是指饮片细粉、提取物、化学药物和亲水性基质(相适宜的)混和均匀后，选择性地涂布于相适宜的背衬材料，进而制成的贴膏剂。复方马钱子凝胶膏剂是以卡波姆为基质，制成凝胶膏剂外用，用于治疗软组织炎症产生的疼痛损伤，具有良好的镇痛和抑制炎症作用[15]。外用凝胶膏作为经皮给药的一种新型制剂，具有保湿性良好、载药量大、对皮肤无刺激及过敏反应、 可反复粘贴、给药剂量可以控制，生产过程中对环境无污染等优点，符合中药大剂量、多组分的用药特点，是近年来研究经皮给药的复方中药新剂型的热点[16]。

凝胶剂是一种极具发展潜力的新剂型。适用于皮肤、腔道及黏膜给药，可避免口服给药存在的首过效应，使药物不良反应减少，遵循“内病外治”的中医理念。同时具有使用方便、舒适、易于涂布、外形美观、不污染衣物、生物相容性好、透皮吸收好等多种优点。近年来，出现的新制药技术，如包合物凝胶制备技术、壳聚糖凝胶剂制备技术、脂质体凝胶制备技术等，使凝胶剂的应用范围扩大，而且多种新技术相结合，使凝胶剂质量更稳定、作用更持久，提高生物利用度，并具有皮肤靶向性作用。因此，凝胶膏剂作为一种新剂型，可制成不同的给药途径，正得到广泛的重视和应用。综上所述，实验中处方中药提取工艺考察，以处方中士的宁提取量和浸膏收率为指标，通过正交试验，确定处方中药最佳提取工艺为以10、8、8倍60%乙醇回流提取3次，每次1.5 h。结果表明，该提取工艺科学合理、稳定可靠，适合于伤科凝胶剂的工业化提取。