共振光散射法测定焙烤食品及饮料中的添加剂——甜蜜素

江虹，刘艳，李侠

(长江师范学院 化学化工学院，重庆 408100)

食品添加剂分为化学合成物质和天然物质两大类，合成添加剂的毒性大于天然添加剂，尤其在添加剂本身质量不纯，混有有害物质或超量使用时很容易对人体造成危害，而食品业使用的绝大多数添加剂是化学合成物质，甜蜜素就是人工合成的一种甜味添加剂，它的甜度为蔗糖的30～50 倍，现被广泛用于糕点、饮料及其他食品中。由于过度使用甜蜜素，会对人体造成一定危害，如引起人体病变，出现畸形、癌症、损坏肾功能等，因此，我国食品安全标准GB 2760 中对甜蜜素在食品中的使用范围和使用限量作了明确规定，如面包和糕点中甜蜜素不得大于1.6 g/kg，饼干和饮料中甜蜜素不得大于0.65 g/kg，尽管如此，食品业的超限量、超范围违规使用仍时有发生。目前，国内外对食品中甜蜜素的研究方法主要有：高效液相色谱法[1-4]、气相色谱法[5-7]、分光光度法[8-9]、电化学法[10-13]、液-质联用法[14-19]及气-质联用[20]等。我国食品安全国家标准GB 1886.37—2015对甜蜜素的检测方法为高氯酸滴定法，此法所用的部分试剂具有毒性或腐蚀性，所用的溶剂冰乙酸就是一种酸性腐蚀性物质，有强烈的刺激性，对人体健康有一定危害；而滴定剂高氯酸不仅具有毒性、强的腐蚀性，还具有燃烧爆炸的危险性。而现在研究较多的高效液相色谱法、气相色谱法及液-质、气质联用等对样品的前处理工作较为繁琐、尤其是净化处理耗时较多。分光光度法虽操作简便，有较高的准确度和精密度，但灵敏度和选择性欠佳。电化学法的条件要求较为苛刻。基于此，研究简便、快速、灵敏的甜蜜素检测方法很有必要。本实验采用高灵敏共振光散射技术，借维多利亚蓝B 与甜蜜素反应生成离子缔合物，使显著增强的共振光散射信号与甜蜜素的质量浓度呈线性关系，建立了测定低脂、低蛋白类焙烤食品及饮料中甜味添加剂——甜蜜素的检测方法，该方法目前尚未见文献报道。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甜蜜素(cyclamate)标准物质：GBW(E)100066，99.3%，中国食品药品检定研究院；维多利亚蓝B(victoria blue B)：99%，武汉易泰科技有限公司上海分公司；三羟甲基氨基甲烷(tris)：99.9%，上海吉至生化科技有限公司；盐酸：AR级，重庆川东(化工)集团有限公司；样品：面包(1#)、饼干(2#)、果味饮料(3#)、可乐型碳酸饮料(4#)，市售。

甜蜜素标准溶液：贮备液为1.00×10-3mol/L水溶液，操作液由贮备液稀释配制成1.00×10-5mol/L水溶液，冰箱4 ℃保存。维多利亚蓝B溶液：贮备液为1.00×10-3mol/L水溶液，操作液由贮备液稀释配制成1.00×10-4mol/L水溶液；Tris-HCl 溶液：由Tris 溶液和HCl 溶液混合，用pH 计测定，配成pH 3.0～9.8的系列溶液。

1.2 仪器与设备

F-2500型荧光分光光度计,日本日立公司；EL104型电子天平,上海精密仪器仪表有限公司；TD5A-WS 型离心机,湖南湘仪离心机仪器有限公司；KQ-200VDE 超声波清洗机,昆山市超声仪器有限公司；pHS-3C 型精密酸度计,上海虹益仪器仪表有限公司。

1.3 样品处理

准确称取已粉碎、混匀的低脂、低蛋白面包及饼干样品各2～3 g(精确至±0.000 1 g)，加适量水，搅拌、浸提10 min，再超声20 min、离心(4 500 r/min)5～10 min，上清液用水定容至100 mL，得到待测液1# 和2#。

准确移取3#和4#饮料各10.00 mL，在温热水浴中超声20 min，用水定容至500 mL，得到待测液3#和4#。

1.4 实验方法

于10 mL 具塞比色管中，准确加入2.50 mL 维多利亚蓝B 操作液、1.50 mL pH 9.27 Tris-HCl 溶液及0.00～2.00 mL 甜蜜素标准操作液，用水稀释至刻度，摇匀。静置20 min 后，在荧光分光光度计上设λex=λem=220 nm，狭缝5 nm，扫描共振光散射光谱，在光谱曲线的特征峰369 nm 处测定体系溶液的共振光散射强度IRLS及试剂空白的共振光散射强度I0，再由IRLS-I0求得体系溶液的共振光散射增强强度ΔIRLS。

2 结果与讨论

2.1 甜蜜素与维多利亚蓝B 的RLS 光谱特征

从图1可知，单独的甜蜜素标准操作液的RLS 信号非常微弱，如曲线1所示。

1-1.00×10-6 mol/L 甜蜜素; 2-2.50×10-5 mol/L 维多利亚蓝B; 3～7-0.00、0.50×10-6、1.00×10-6、1.50×10-6、2.00×10-6 mol/L 甜蜜素,2.50×10-5 mol/L 维多利亚蓝B,pH 9.27混合液

单独的维多利亚蓝B 操作液的RLS 信号较弱，在400 nm 处有一最大散射峰，如曲线2所示。当在维多利亚蓝B 操作液中加入Tris-HCl(pH 9.27)溶液后，RLS 信号显著增强，如曲线3所示。在曲线3 溶液的基础上加入0.00～2.00 mL 的甜蜜素标准操作液，从曲线3～7可知，光谱曲线在369 nm 处有一最大特征散射峰，此峰与单独的维多利亚蓝B 相比较，红移31 nm。在体系溶液的特征峰处，一定浓度范围的甜蜜素的质量浓度(或物质的量浓度)与体系溶液的共振光散射增强强度ΔIRLS呈线性关系。故选择369 nm 作为测定波长，用于甜蜜素的定量分析。

2.2 适宜条件的选择

2.2.1 反应酸度

取甜蜜素标准操作液1.00 mL、维多利亚蓝B操作液2.00 mL时，按1.4 节方法考察1.00 mL pH 3.0～9.8 范围的Tris-HCl 溶液对甜蜜素-维多利亚蓝B 体系ΔIRLS的影响，结果见图2。从ΔIRLS-pH 曲线可知，甜蜜素与维多利亚蓝B 反应所需加入的Tris-HCl溶液的pH为9.27，当加入的溶液的pH>9.27或<9.27时，体系的ΔIRLS均有不同程度降低，pH 9.27 时，体系的ΔIRLS较大，灵敏度较高。故实验选用pH 9.27 Tris-HCl 溶液来控制该反应的酸度。

图2 Tris-HCl 溶液酸度对ΔIRLS的影响

2.2.2 Tris-HCl 溶液(pH 9.27)的用量

取甜蜜素标准操作液1.00 mL、维多利亚蓝B操作液2.00 mL，按1.4 节方法考察0.50～3.00 mL 范围的pH 9.27 Tris-HCl 溶液对甜蜜素-维多利亚蓝B 体系ΔIRLS的影响，结果见图3。

图3 Tris-HCl(pH 9.27)用量对ΔIRLS的影响

从ΔIRLS-VpH 9.27曲线可知，甜蜜素与维多利亚蓝B 反应所需加入Tris-HCl溶液(pH 9.27)的最适用量为1.50 mL，溶液用量大于或小于1.50 mL，体系的ΔIRLS均有不同程度下降。故实验选择体系灵敏度最大时的Tris-HCl(pH 9.27)溶液用量为1.50 mL。

2.2.3 维多利亚蓝B 浓度

取甜蜜素标准操作液1.00 mL、pH 9.27 Tris-HCl 溶液1.50 mL，按1.4 节方法考察0.50～3.00 mL 范围的维多利亚蓝B 操作液对甜蜜素-维多利亚蓝B 体系ΔIRLS的影响，结果见图4。从ΔIRLS-c维多利亚蓝B曲线可知，维多利亚蓝B 的最适浓度为2.50×10-5mol/L(即维多利亚蓝B 操作液的最适用量为2.50 mL)，当维多利亚蓝B 浓度大于或小于该值时，体系ΔIRLS均有不同程度下降，当<2.50×10-5mol/L 时，维多利亚蓝B 用量不够，与甜蜜素反应不完全；当>2.50×10-5mol/L 时，又因维多利亚蓝B 过量使自身聚集作用增强从而影响与甜蜜素间的反应，灵敏度随之下降。故实验选择体系灵敏度最大时的维多利亚蓝B 溶液的浓度即2.50×10-5mol/L。

图4 维多利亚蓝B 浓度对ΔIRLS 的影响

2.2.4 试剂加入顺序

取甜蜜素标准操作液1.00 mL、pH 9.27 Tris-HCl 溶液1.50 mL、维多利亚蓝B 操作液2.50 mL，按1.4 节方法考察这几种物质在加入顺序不同时对体系ΔIRLS的影响。结果显示，这几种物质加入的先后顺序对甜蜜素与维多利亚蓝B 反应的ΔIRLS有一定影响。当加入顺序为维多利亚蓝B 溶液、Tris-HCl 溶液、甜蜜素溶液时，体系的ΔIRLS=1315(相对于其他加入顺序，该顺序的ΔIRLS最大)，灵敏度相对其他顺序最高。故实验选择此最佳顺序加入各物质。

2.2.5 反应时间及稳定性

按上述选定的最佳条件，考察甜蜜素与维多利亚蓝B 的反应在5～100 min 范围内对体系ΔIRLS的影响。结果显示，反应从开始至20 min 时，随着反应时间的增加，体系ΔIRLS逐渐增大，表明此时间段的反应并未完全；当反应至20～70 min 范围，随着反应时间的增加，体系的ΔIRLS不再增大，基本处于稳定状态，表明此时间段内反应已完全，并可稳定50 min；当反应至70 min 后，体系的ΔIRLS随时间的增加而逐渐下降，表明生成的新物质在此段时间已不再稳定。故测定时间选在新物质稳定时间段内进行。

2.3 工作曲线及相关参数

按1.4 节的实验方法，配制0.00、0.50、1.00、1.50、2.00 mL 甜蜜素标准操作液的标准系列溶液，扫描RLS 光谱，作甜蜜素的标准曲线，见图5。该方法的一元线性回归方程为ΔIRLS=14.20+7 038ρ，相关系数r=0.999 7，线性范围为0.004～0.4 mg/L，检出限为0.003 5 mg/L，面包和饼干的定量限为2.69 mg/100 g，饮料的定量限为29.2 mg/L。

图5 甜蜜素的标准曲线

2.4 离子强度的影响

室温下，考察了不同质量浓度的NaCl 溶液对体系ΔIRLS的影响。结果显示，7 400 倍的NaCl 溶液对甜蜜素的测定无影响。故离子强度不影响甜蜜素的测定。

2.5 共存物质的影响

2.6 样品分析

准确移取各待测液0.20 mL 代替1.4节实验方法中的甜蜜素标准操作液，加入最佳条件下的维多利亚蓝B 和Tris-HCl 溶液，用水定容至10 mL。按实验方法测定面包、饼干及饮料中的甜蜜素含量，并与GB 1886.37—2015比较。从表1数据可知，测定结果与GB法基本一致，统计学检验结果表明新方法具有可靠性。

表1 面包、饼干及饮料的分析结果

加标回收试验：准确称取1#和2#已粉碎、混匀的面包、饼干样品各3份，每份2～3 g(精确至±0.000 1 g)，分别置于小烧杯中；准确移取3#和4#饮料各3份，每份10.00 mL，分别置于小烧杯中。在1#～4#的小烧杯样液中，分别往同一样液的3份烧杯中加入0.50、1.50和3.00 mL甜蜜素贮备液，后续操作按1.3节样品处理方法进行，制得各待测液。取各待测液0.20 mL，按实验方法测定各待测液中甜蜜素的含量(n=5)，求回收率，以判断方法的准确度。结果见表2。表2中加标回收率和相对标准偏差表明新方法有较高的准确度和精密度。

表2 面包、饼干及饮料的回收试验(n=5)

3 结论

维多利亚蓝B-甜蜜素体系用于食品中甜蜜素的测定，该方法具有操作简单、灵敏度高、选择性好等优点，准确度和精密度满足定量分析要求，并有较宽的线性范围。测定结果的准确度与国标法相比无显著性差异。本方法适用于焙烤食品中低脂低蛋白的面包、饼干及饮料中甜蜜素的快速测定。