感应电场处理后蓝莓泥酶活性及总花青素含量变化

金亚美，黄煦，徐悦，吴凤凤，徐学明，金征宇，廖小军，杨哪*

1(江南大学 食品学院，江苏 无锡，214122) 2(食品科学与技术国家重点实验室(江南大学)，江苏 无锡，214122) 3(中国农业大学 食品科学与营养工程学院，北京，100083)

蓝莓营养价值高，富含酚酸、SOD、类黄酮和花色苷等生物活性物质，尤其是其中的花青素成分，具有优良的清除自由基、抗炎症功效，能够预防老年痴呆、心血管疾病以及延缓衰老[1-2]。蓝莓果泥产品特殊的流态性质使其不仅能被普通消费者食用，还可针对婴幼儿和老年人等特殊消费群体所设计，具有广阔的消费市场。蓝莓中的多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)和过氧化物酶(peroxidase, POD)易导致蓝莓果泥发生褐变，对其感官品质和营养价值产生负面影响[3-4]。

现在食品工业中果泥的杀菌灭酶多采用热处理的方式，但是高温容易造成热敏性功能成分的破坏损失。因此，新型的非热加工技术如高压脉冲电场[5]、超高压处理[6]、高压二氧化碳[7]、脉冲磁场[8]、中强度电场[9]、欧姆加热[10]、电离辐射等[11]得到广泛关注。其中欧姆加热、高压脉冲电场和中强度电场采用金属电极直接接触食品并施加电压以达到对物料的灭酶处理效果，但是在通电过程中由于食品和金属极板间发生电化学反应，使得极板金属离子进入食品原料，造成原料污染[12-13]。因此，以电场为媒介的食品非热加工技术的发展受到了很大限制。

利用电磁感应原理，即在初级线圈上施加电压，就会在闭合铁氧体内产生交变磁场，通过电能-磁能-电能的耦合转换后，当流动的蓝莓果泥作为次级线圈时，交变磁场会在次级线圈中的样品内产生感应电场，从而实现对蓝莓泥的处理。目前关于感应电场的应用集中于其对流动料液的间歇式处理[14-16]，但这种处理方式并不适于大规模生产，而本研究使用的感应电场系统可以实现连续式的样品处理。相对于其他电场加工技术，利用电磁感应在螺旋状连续流的蓝莓泥中得到高强度的电势差，为一种新的蓝莓泥加工技术研究提供了参考。本试验探究了不同强度感应电场处理对蓝莓果泥PPO和POD酶活的影响，确定灭酶的处理时间、激励电压和温度参数，分析感应电场处理后的蓝莓果泥总花青素含量变化。

1 材料与方法

1.1 实验材料

佳沃蓝莓、矮丛蓝莓，购于无锡欧尚超市。KH2PO4、K2HPO4、NaH2PO4、Na2HPO4、邻苯二酚、愈创木酚、H2O2(30%)、C2H4O2(98%)、HCl、C2H3NaO2、NaCl、C2H6O、NaOH、琼脂、胰蛋白胨、酵母浸膏、C6H12O6，均为分析纯，购于国药公司；实验用水均为去离子水。

1.2 仪器与设备

IEF处理装置如图1所示。装置中含有4个反应单元，其初级铜线线圈(NPi=15)、次级料液线圈(NSi=25匝，内径8 mm，壁厚2 mm)外围的玻璃腔体用于保持处理温度。反应器以串联的方式连接构成整个连续流体系。工作时，电源发出激励电压(UPi)施加在初级线圈上，次级样品线圈上产生感应电压(ESi)。根据法拉第电磁感应定律，交变的磁通量使相邻样品线圈之间产生电位差。

a-交变电源；b-恒温水浴装置；c-样品瓶；d-料液流路；e-反应单元；f-恒温循环水流路；g-恒温循环水浴装置；h-蠕动泵

其他主要仪器：分光光度计(TU1900)，北京普析通用仪器有限公司；高速冷冻离心机(BK-TD6G)，山东博科生物产业有限公司；阻抗分析仪(65120B)，英国Wayne Kerr electronics公司；流变仪(DHR-3)，美国沃特世公司。

1.3 蓝莓果泥的处理

每次称取900 g蓝莓，加入300 g去离子水，用破壁机破碎6 min后立即进行感应电场处理。通过改变输出电压(100、150和250 V)、处理时间(0～60 min)和温度(65、75和85 ℃)作为不同的IEF处理组，以相同条件下但输出电压为0 V的样品作为对照组。

1.4 PPO活性的测定

根据QUEIROZ等[17]的方法并稍加修改进行PPO酶活的测定。称取2.5 g蓝莓果泥，加入5 mL磷酸钾缓冲溶液(0.2 mol/L, pH 6.5)，匀浆30 s，吸取2 mL匀液，4 ℃离心(10 000×g)15 min，取0.1 mL上清液用磷酸钾缓冲液稀释至1 mL，测量425 nm 波长处的吸光值。

1.5 POD活性的测定

根据AYDIN等[18]的方法并稍加修改进行POD酶活的测定。称取2.5 g蓝莓果泥，加入5 mL上述磷酸钠缓冲溶液，匀浆30 s，4 ℃离心(10 000×g)15 min。取上清液1 mL，加入1.83 mL磷酸钾缓冲液，0.15 mL 30%的H2O2溶液，1 mL 0.1 mol/L邻苯二酚溶液混合，测量470 nm波长处的吸光值。

1.6 残余酶活力的计算

PPO和POD的残余酶活力(RA)按公式(1)计算：

(1)

式中:A0和At分别表示处理前后果泥样品种的酶活性。

1.7 总花青素含量的测定

根据吴振等[19]的pH示差法并稍加修改。称取2.5 g样品，加入10 mL体积分数60%的酸性乙醇溶液(内含0.03 mL HCl)，在30 ℃下水浴振荡30 min，再置于60 ℃下超声(功率为100 W)提取50 min，离心(4 000 r/min)20 min，取上层清液2 mL，分别用pH 1.0(HCl-NaCl缓冲溶液)和pH 4.5(醋酸-醋酸钠缓冲溶液)缓冲液稀释至4 mL，测2者在510 nm和710 nm波长处的吸光值。总花青素按公式(2)、(3)计算

A=(A510-A710)pH1.0-(A510-A710)pH4.5

全年龄的都有可能发生局结节样增生。而且女性患者的发病率比较高。约有80%的肝脏局灶性结节性增生患者都没有明显的症状,一般都是在体检的时候发现典型CT表现,如平扫密度稍低,使用增强扫描动脉有中央瘢痕,病灶均匀强化,门脉期的病灶密度下降,延迟期的病灶为等密度表现,使用动态CT增强扫描在13个病灶中发现了7个中央瘢痕,肝脏局灶性结节性增生的主要特征就是在延迟期有中央瘢痕强化。

(2)

(3)

式中：A，吸光值；Mw，矢车菊素-3-葡萄糖苷的相对分子质量，449.2；DF，稀释倍数；V，提取液的总体积，mL；e，矢车菊素-3-葡萄糖苷的消光系数，26 900；b，比色光程长度，1 cm；m，试液质量，g。

1.8 蓝莓果泥阻抗的测定

使用阻抗分析仪对蓝莓果泥的阻抗进行测定。在测试前分别进行开路(空气)、短路和高频(100 Ω电阻，10、100 pF电容)于20～106Hz校正，然后测定样品流体在400 Hz下的阻抗。

1.9 蓝莓果泥表观黏度的测定

使用HR-3型流变仪测定不同处理(未经热处理、常规热处理、IEF处理)蓝莓果泥的表观黏度，选用直径为40 mm的平行板，平行板间距为1 mm，采用稳态扫描模式，测量温度为25 ℃，剪切速率从0 /s上升到100 /s。

1.10 蓝莓果泥微生物的测定

参照GB 4789.2—2016对蓝莓果泥在0～8周储藏期间的菌落总数进行测定[20]，不经热处理的鲜榨蓝莓果泥的初始菌落约为3.32 lg(CFU/mL)。

1.11 数据处理

采用Origin 8.5软件进行拟合及图形化处理，使用SPSS 22.0进行数据处理并用Duncan极差法进行显著性分析，采用标准偏差表征数据误差，P<0.05则说明差异显著。

2 结果与分析

2.1 蓝莓果泥PPO和POD活性的影响因素

2.1.1 IEF对蓝莓果泥PPO和POD活性的影响

a-PPO酶活力;b- POD酶活力

2.1.2 不同温度下IEF对蓝莓果泥PPO和POD的影响

在激励电压为250 V时，不同温度(65、75和85 ℃)下IEF处理对蓝莓果泥PPO和POD残余酶活的影响如图3所示。对于PPO，在常规加热处理45和60 min后，残留活性分别为4.34%和0.65%，而通过250 V激励电压的IEF在75 ℃处理45 min和85 ℃处理30 min后，蓝莓果泥PPO几乎完全失活。对于POD，经75 ℃ 6 min或 85 ℃ 3 min的IEF(250 V)处理可被完全灭活；而不施加感应电场作用，需要在75 ℃下热处理9 min或85 ℃ 下处理6 min方可被完全灭活。因此，与传统热处理相比，IEF可缩短加工时间或降低加工温度，具有减缓食品物料因严苛加工条件引起的营养成分损失和感官品质降低的潜力。

a-PPO酶活力；b- POD酶活力

2.2 感应电场处理对蓝莓果泥中总花青素含量的影响

2.2.1 不同温度下IEF处理对蓝莓果泥中总花青素含量的影响

以不同处理下总花青素的变化量(处理tmin时物料中总花青素含量与0 min花青素含量的差值)为指标，考察感应电场对花青素的影响。对照组(0 V)在不同温度(65、75和85 ℃)下其总花青素含量随处理时间的变化趋势如图4所示。

图4 不同温度热处理蓝莓果泥的总花青素含量变化

在65和75 ℃热处理条件下，蓝莓果泥中总花青素含量随处理时间先增加后降低，但65 ℃时总花青素含量变化转折点滞后于75 ℃组。而85 ℃的热处理则使蓝莓果泥中总花青素含量一直下降，这与MARTYNENKO等[24]研究的蓝莓果泥的热降解动力学结果一致。原因可能是自然界中的花青素一般不是以游离的形式存在，而是会与植物中的某些蛋白质结合或固定在纤维结构中。适当地热处理可能会破坏花青素和这些物质的结合而游离出来，从而提高花青素的提取率，但温度过高或处理时间过长会进一步破坏游离出来的花青素[25]。

不同温度(65、75和85 ℃)下IEF(250 V)处理组总花青素含量随处理时间的变化趋势如图5所示。由图5可知，不同于对照组，处理组总花青素含量均随处理时间的增加而增加，且温度越高总花青素含量增加速率越快，未观测到高温对花青素的破坏作用，说明感应电流可能会影响花青素结构，降低花青素热敏感性，从而保持花青素的稳定性。在处理温度为65 ℃，时间分别为30和60 min时，总花青素含量分别上升了3.33%和6.28%；在处理温度为85 ℃，时间分别为30和60 min时，总花青素含量分别上升了12.55%和8.34%，其中最大值出现在250 V，85 ℃，30 min条件下。

图5 不同温度及感应电场处理(IEF，250 V)蓝莓果泥的总花青素含量变化

2.2.2 不同电压下IEF处理对蓝莓果泥中总花青素含量的影响

在温度为85 ℃时，结合不同激励电压(0、100、150和250 V)对蓝莓果泥中总花青素含量的影响如图6所示。

图6 不同激励电压感应电场处理(IEF，85 ℃)蓝莓果泥的总花青素含量变化

在温度85 ℃、激励电压0 V(对照组)，随着处理时间的增长，总花青素含量不断下降，在60 min时，下降量达到16.13%。采用IEF处理，花青素受热降解损失得到缓解，且激励电压越大即蓝莓果泥料液中的感应电场和感应电流越强，总花青素含量越高。其中，在激励电压为250 V，处理时间为10、30、45和60 min时，样品中总花青素含量增加量最多，分别增加5.58%、12.55%、8.93%和8.34%。由此可知，电磁感应效应激发的微弱感应电流对花青素的分子结构具有稳定作用，且能够提高蓝莓果泥产品中总花青素的含量。

2.3 IEF处理过程中蓝莓果泥阻抗的变化

图7展示了在85 ℃、不同激励电压(100、150和250 V)IEF处理和常规热处理(0 V)过程中蓝莓果泥阻抗的变化趋势。

图7 不同激励电压感应电场处理(IEF, 85 ℃)过程中对蓝莓果泥的阻抗

经测定未经任何处理的蓝莓果泥阻抗为(6.74±0.01)kΩ。由图7可知，随着处理时间的延长和激励电压的提高，蓝莓果泥的阻抗逐步降低，即其导电性逐步提升。这是由于处理过程中蓝莓果肉细胞不断破裂，细胞内部的有机酸、小分子糖等极性分子和无机离子不断溶出，从而增强了蓝莓果泥料液的导电性能。根据变压器初次级电压的比例关系，增大激励电压，则次级料液线圈中的感应电压随之增大，高电压进一步破坏了蓝莓细胞的完整结构，表现为果泥样品阻抗的进一步下降。

2.4 不同处理蓝莓果泥的表观黏度

流变特性与食品组分的分子结合状态及组织构造紧密相关[26]。由图8可知，随着剪切速率的增大，不同处理蓝莓果泥产品的表观黏度均随剪切速率的增加而下降，表现出假塑性流体流动特点。当剪切速率>25 /s时，蓝莓果泥的表观黏度趋于稳定。在低剪切速率下，鲜榨蓝莓果泥的表观黏度最大，IEF组次之，0 V对照组最小。原因可能是热处理可促进分子间相互作用，增大料液体积和单分子运动所占的体积，从而黏度降低[27]；而感应电场抑制了果泥颗粒的膨胀和单分子运动体积的增长，抑制了由热处理引起的黏度降低。因此，IEF处理的蓝莓果泥表观黏度与鲜榨果泥更为接近。

图8 不同处理方法蓝莓果泥的表观黏度

2.5 不同处理蓝莓果泥储藏期微生物数量变化

由以上蓝莓果泥PPO、POD残余酶活力和总花青素含量分析可以得出，在250 V、85 ℃、30 min的IEF处理条件下，产品总花青素含量最高且PPO和POD可被完全灭活。因此，进一步研究了该最优处理条件下获得的蓝莓果泥产品在4 ℃储藏期间的微生物安全性，并与新鲜未处理果泥、和85 ℃、30 min常规热处理的蓝莓果泥进行了对比，测定结果如图9所示。

图9 不同处理条件下蓝莓果泥在4 ℃储藏期间菌落总数

储藏周期8周内，未经热处理果泥的菌落总数由3.32逐步增长到5.97 lg(CFU/mL)。85 ℃、30 min(0和250 V)的热处理均可使微生物数量降低到0～2 lg(CFU/mL)，但对照组果泥的菌落总数在储藏期间呈现缓慢上升的趋势，第8周时达到1.48 lg(CFU/mL)，这是由于果泥中部分未被完全杀灭的微生物后期增殖所致。而250 V 激励电压IEF处理果泥的菌落总数稳定在0.2 lg(CFU/mL)左右。由此可见，IEF具有延长蓝莓果泥货架期的作用。相似地，利用高压脉冲电场对液体果蔬制品进行灭菌处理以延长产品保质期也已有诸多研究报道[28]。

3 总结

采用IEF处理，低电压(100 V)可延缓蓝莓果泥PPO和POD活性的热损失，而高电压(150和250 V)有促进PPO和POD钝化失活的作用。蓝莓果泥总花青素含量是热提取和热降解综合作用的表现，在温和热处理条件下(65 ℃)，样品花青素含量呈现先增加后降低的趋势，随着处理温度的升高，蓝莓花青素由增加到降低的转折点也随之提前。85 ℃的热处理(0 V)对蓝莓果泥花青素具有降解破坏作用，表现为蓝莓果泥中的总花青素含量呈现一直降低的趋势。但若施加250 V的激励电压作用，样品中总花青素含量呈现先增加后降低的趋势，最大值出现在处理30 min时刻，说明由电磁感应在次级蓝莓线圈中激发的感应电压和感应电流具有维持花青素分子结构稳定的作用，从而提高花青素分子的耐热性，并确定250 V、85 ℃和30 min为最优IEF处理条件。此条件下获得的蓝莓果泥产品与鲜榨果泥的表观黏度更为接近；在8周的4 ℃储藏期间，其微生物菌落总数显著低于常规热处理组和未经热处理组(P<0.05)，可以维持在1个对数单位以下。