QuEChERS结合超高效液相色谱质谱法测定禽蛋及其制品中42种农药及其代谢物

吕青骎，王玮，梁丽姣，滕爽，徐幸莲*

1(南京农业大学 食品科技学院，江苏 南京，210095)2(南京农业大学 国家肉品质量安全控制工程技术研究中心，农业农村部肉及肉制品质量监督检验测试中心(南京)，江苏 南京，210095)3(南京财经大学 食品科技与工程学院，江苏 南京，210095)

农药的广泛使用在提高农作物产量的同时也造成了农药残留，影响农产品和食品安全。常见农药种类主要有有机卤素农药、有机磷农药、氨基甲酸酯类农药、拟除虫菊酯农药、有机氮农药等[1-2]。在禽类饲养过程中，有些不易降解的农药会通过食物链富集并传递至禽类体内[3]，造成禽蛋中农药残留。另外,喷洒农药防止病害，环境污染等都会导致禽蛋中残留农药[4-5]。世界各国和国际组织制定了严格的禽蛋中农药最大允许残留限量[6]，如欧盟为411种，日本为236种，美国为90种，而我国仅为9种，且限量值较高[7]。我国是禽蛋生产和消费大国，禽蛋质量安全关系到消费者身体健康和国家经济利益[8]。因此建立简便快捷，灵敏准确的禽蛋中农残检测方法很有必要。

现行农药测定标准大都针对蔬菜水果饲料等[9-10]，不能直接应用于禽蛋及制品的检测。动物性食品中农药残留样品前处理方法主要有固相萃取法[11]、凝胶渗透色谱法[12]、加速溶剂萃取法[13]、QuEChERS法[14]等。其中，固相萃取法、凝胶渗透色谱法、加速溶剂萃取法均可准确分离出农药残留成分，但操作步骤繁琐，费时费力，且试剂消耗量大，不利于环保[15]；QuEChERS法不仅可准确分离出农药残留成分，还具有操作简便、检测成本低、环境友好、检测高效等优势[16]，因此，选取QuEChERS法作为本试验样品的前处理方法。农药残留检测方法主要有酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)[17]、气相色谱法(gas chromatography, GC)[18]、气相色谱-质谱联用法(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)[19]、高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)[20]等。其中，ELISA主要用于大规模样品的初步筛查[21]；GC与GC-MS常用于易挥发、分子量较小且热稳定性好的样品，检测农药残留的种类有限[22]；HPLC易受到复杂基质的干扰且效率较低[23]；而超高效液相色谱串联质谱法(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS)可实现多种物质同时检测与分析，检测速度快、灵敏度高[24]。本试验采用QuEChERS方法对禽蛋及其制品进行前处理，建立了可同时检测42种农药及其代谢物的UPLC-MS/MS方法，旨在为我国禽蛋及其制品中农药残留的高通量快速检测以及食品安全提供科学支持和技术保障。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试材料为禽蛋及制品，包括鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋、蛋粉，购自南京农贸市场和超市等。

标准品：啶虫脒(acetamiprid)、阿维菌素(avermectin B1a)、氯虫苯甲酰胺(chlorantraniliprole)、毒死蜱(chlorpyrifos)、苯醚甲环唑(difenoconazole)、烯酰吗啉(dimethomorph)、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐(emamectin benzoate)、甲氰菊酯(fenpropathrin)、氟虫腈(fipronil)、氟甲腈(fipronil-desulfinyl)、氟虫腈硫醚(亚砜)(fipronil-sulfide)、氟虫腈砜(fipronil-sulfone)、吡虫啉(imidacloprid)、辛硫磷(phoxim)、哒螨灵(pyridaben)、嘧霉胺(pyrimethanil)、胺菊酯(tetramethrin)、三环唑(tricyclazole)、抑霉唑(imazalil)、三唑酮(triadimefon)、戊唑醇(tebuconazol)、克百威(carbofuran)、3-羟基克百威(3-hydroxy-carbofuran)、多菌灵(carbendazim)、灭幼脲(chlorbenzuron)、氟啶脲(chlorfluazuron)、二嗪磷(diazinon)、敌敌畏(dichlorvos)、乙霉威(diethofencarb)、除虫脲(diflubenzuron)、乐果(dimethoate)、水胺硫磷(isocarbophos)、马拉硫磷(malathion)、灭多威(methomyl)、咪鲜胺(prochloraz)、丙溴磷(profenofos)、氟胺氰菊酯(tau-fluvalinate)、噻虫嗪(thiamethoxam)、三唑磷(triazophos)、甲基对硫磷(parathion-methyl)、噻嗪酮(buprofezin)、甲萘威(carbaryl)，德国Dr. Ehrenstorfer公司，纯度均≥95.0%。

试剂：乙腈、甲醇、乙酸乙酯,均为色谱纯，美国Fisher公司；甲酸、乙酸、二氯甲烷、NaCl、MgSO4、Na2SO4，HCOONH4,均为分析纯，上海安谱实验科技股份有限公司；QuEChERS多功能针式过滤膜，天津阿尔塔科技有限公司；试验中用水均为一级水。

1.2 仪器与设备

Vanquish & TSQ Quantis超高效液相色谱质谱仪，美国Thermo Fisher Scientific公司；advance EDI纯水仪、CPA224S电子天平、D-16C高速离心机，德国Sartorious 公司；X025-12DTD超声波清洗机，南京先欧仪器制造有限公司；Vortex Genius漩涡混匀器，德国IKA公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品的前处理

提取：准确称取5.00 g均质好的样品，置于50 mL离心管中，加入5 mL一级水，10 mL体积分数为1%的乙酸乙腈，涡旋1 min，40 kHz超声提取10 min。再加入3 g NaCl，涡旋混合1 min，10 000 r/min离心10 min。

净化：用一次性注射器取1 mL上清液(再吸入1 mL空气)，匀速通过QuEChERS多功能针式过滤膜至进样瓶中，进行UPLC-MS/MS分析。

除不称取试样，按上述前处理步骤完成试剂空白实验。

1.3.2 标准溶液的配制

分别称取100.0 mg 42种农药的标准品，乙腈稀释，定容到100.00 mL容量瓶中，配制成质量浓度为1.00 mg/mL的标准储备液。

分别移取100 μL 42种农药标准储备液用乙腈稀释，定容到100.00 mL容量瓶中，配制成1.00 μg/mL混合标准溶液。

移取一定量的混合标准溶液，用空白样品提取液配制成不同质量浓度的基质匹配混合标准工作溶液，用于建立标准曲线，浓度梯度为0.5、1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/L。基质匹配混合标准工作溶液应现配现用。

1.3.3 UPLC-MS/MS方法的建立

1.3.3.1 液相色谱条件

色谱柱：Thermo Accucore aQ C18(2.1 mm×150 mm, 2.6 μm)；流动相A：体积分数为0.1%的甲酸水溶液，流动相B：5 mmol/L甲酸铵甲醇溶液；梯度洗脱条件：0～1.00 min，90%A保持不变；1.00～5.00 min，90% A线性变化10%；5.00～9.00 min，10%A保持不变，9.00～9.01 min，10%A变化至90%；9.01～11.00 min，90%A保持不变；流速0.3 mL/min；柱温40 ℃；进样量：10 μL。

1.3.3.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源(electrospary ionization, ESI)；扫描方式：正反离子扫描；检测方式：多反应监测；正离子喷雾电压：3 500 V；负离子喷雾电压：2 500 V；鞘气流速：40 Arb；辅助气流速：10 Arb；离子传输管温度：300 ℃；雾化温度：200 ℃。

1.3.4 线性范围的确定

基于已建立的UPLC-MS/MS方法，将配制好的基质匹配标准工作溶液上机测定，线性范围为0.5～100 μg/L，最低点设定为出峰良好的最低浓度，共设定6个浓度点。以定量离子质量色谱峰面积为纵坐标(Y)，对应溶液浓度(μg/L)为横坐标(X)，绘制标准曲线，求回归方程，计算平方相关系数(square of correlation coefficient,R2)。

1.3.5 准确度和精密度试验

在阴性鸡蛋液中分别添加3个水平农药混合标准溶液，添加量为5、10、50 μg/kg，依照1.3.1进行提取和净化，上机进行添加回收率实验，每个添加浓度平行测定6个样品，计算相对标准偏差(relative standard deviations, RSD)，得到精密度。

1.3.6 方法的实际应用

选用市售禽蛋及其制品23份，其中鸡蛋8份，鸭蛋5份，鹅蛋3份，蛋粉7份。其样品前处理和检测方法参照1.3.1和1.3.3，以此来评价该方法的实际应用效果。

1.4 数据分析

使用Thermo Scientific XCalibur工作站软件(版本号：4.1.31.9)进行数据采集和处理。

2 结果与分析

2.1 前处理方法的优化

2.1.1 提取试剂的优化

根据分析物在不同溶剂中的溶解性，分别采用乙腈、乙酸乙酯、正己烷、石油醚、二氯甲烷作为提取溶剂进行前处理，向阴性鸡蛋液中添加10 μg/kg的农药混合标准液，参照1.3.1进行前处理。

表1 提取溶剂对42种农药回收率的影响

结果表明：使用5种提取溶剂提取42种农药，回收率在70%～120%范围内个数分别为42、30、13、13、34种。有机磷类农药、氨基甲酸酯类农药极性偏强，使用正己烷、石油醚等非极性溶剂提取效果较差；二氯甲烷提取后为乳状物，难以分离；乙腈总体回收率高于乙酸乙酯，为最优选择。

部分农药属于两性化合物，提取溶剂的pH影响提取效果，因此在乙腈中添加乙酸以改善回收率。分别使用体积分数0.5%、1%、3%、5%的乙酸乙腈进行试验，结果表明，乙酸添加量为体积分数1%时，目标农药回收率均在70%～120%范围内(表2)，且与乙腈相比回收率更好。例如使用乙腈时，氯虫苯甲酰胺和甲氨基阿维菌素苯甲酸盐回收率为118%和74%，而使用1%乙酸乙腈时，回收率分别为98%和94%。因此选用1%乙酸乙腈作为本试验提取溶剂。

表2 乙酸含量对42种农药回收率的影响

2.1.2 除水剂的优化

试样中添加无机盐可除水同时促进电离，分离有机相与水相，防止乳化，常见的除水剂有NaCl、Na2SO4、MgSO4等。向阴性鸡蛋液中添加10 μg/kg的农药混合标准液，参照1.3.1设置7组不同剂量无机盐作为除水剂进行对照试验。结果表明，增加NaCl用量至3 g时，目标农药回收率均在70%～120%范围内，继续增加NaCl用量回收效果无明显变化(表3)。

表3 除水方法对42种农药回收率的影响

使用MgSO4与Na2SO4时，回收率在70%～120%范围内的目标农药数量均为39种，因此选择NaCl作为除水剂，添加量为3 g。

2.1.3 净化方法的选择

向阴性鸡蛋液中添加10 μg/kg的农药混合标准液，比较固相萃取法与QuEChERS法净化效果。固相萃取法选用Oasis PRiME HLB(6 cc, 200 mg)小柱，净化后回收率在70%～120%范围内农药种类仅为33种。QuEChERS法选用含50 mgN-丙基乙二胺(PSA)与50 mg C18的多功能针式过滤膜，PSA可去除脂肪酸、有机酸、糖类，C18多用于吸附脂肪、多环芳烃等弱极性物质，联合使用可有效去除动物源性食品中的脂肪及弱极性化合物。净化后的提取液为浅黄色接近无色，净化效果较好，回收率为76.77%～113.22%，满足检测要求。

2.2 质谱条件的优化

将浓度为100 ng/mL的42种农药混合标准溶液以3 μL/min流速直接注入质谱，全扫描模式确定各农药母离子，再进行子离子扫描，每个化合物选定2对响应高的特征离子对作为定性、定量离子对，进一步优化碰撞能量，最终得到质谱参数(表4)。

表4 42种农药质谱参数

续表4

序号名称反应模式母离子(m/z)子离子(m/z)碰撞能量/V13吡虫啉+256.13175.14209.10211914辛硫磷+299.1377.31129.15291315哒螨灵+365.15147.11309.00241016嘧霉胺+200.19168.10181.14334017胺菊酯+332.24135.20164.12212518三环唑+190.01135.97163.04282319抑霉唑+297.13159.04255.02262020三唑酮+294.12111.13141.08472521戊唑醇+308.2070.34125.11243522克百威+222.18123.16165.132515233-羟基克百威+238.06163.04181.04135024多菌灵+192.15132.15160.13332025灭幼脲+309.02138.95155.93271426氟啶脲+539.99247.00382.97462327二嗪磷+305.15153.11169.05202028敌敌畏+221.0279.25109.15292029乙霉威+268.20124.16180.14352030除虫脲-309.02155.97289.04101031乐果+230.0679.24125.08332432水胺硫磷+312.00236.01269.95151433马拉硫磷+330.9698.92127.00211034灭多威+160.0488.11106.04101035咪鲜胺+376.0970.35307.98261036丙溴磷+374.98304.84346.92211537氟胺氰菊酯+503.15181.10208.07251638噻虫嗪+292.10181.10210.97261039三唑磷+314.09119.18162.103521

续表4

序号名称反应模式母离子(m/z)子离子(m/z)碰撞能量/V40甲基对硫磷+264.09122.00231.92251041噻嗪酮+306.2357.45106.22252842甲萘威+202.16127.15145.113111

2.3 标准曲线的线性，检出限和定量限

本试验为基质匹配混合标准曲线，采用外标法定量。42种农药在0.5～100 μg/L范围内，呈良好线性相关，相关系数均大于0.990 0。按已建立的UPLC-MS/MS方法，在阴性鸡蛋液中添加一定量的标准溶液进行试验，以3倍信噪比计算检出限，10倍信噪比为定量限(表5)，42种农药检出限为0.01～0.5 μg/kg，定量限为0.034～1.7 μg/kg，表明该方法有较高的灵敏度。

2.4 准确度与精密度

将不同浓度的标准液分别添加至阴性鸡蛋液中，制备不同添加浓度的样品，参照1.3.1前处理后上机检测，进行准确度和精密度测定。由表6可知，3个不同浓度水平测得的加标回收率在74.13%～113.22%，RSD在0.98%～14.29%，表明本方法准确度高，精密度好，可以满足禽蛋中农药检测。

2.5 实际样品的测定

为验证该方法的实际应用价值，选取23份市售禽蛋及其制品为研究对象，其中鸡蛋8份，鸭蛋5份，鹅蛋3份，蛋粉7份。试验结果鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋均未检出农药残留，蛋粉有3份检出(表7)。

3 结论

本试验将QuEChERS前处理技术与UPLC-MS/MS检测方法相结合，同时检测禽蛋及制品中42种农药及其代谢物残留，操作简便快捷，分析时间短，灵敏度高。低、中、高三水平加标回收率在74.13%～113.22%，相对标准偏差均小于15%，表明该方法在不同浓度水平具有较高的精密度与准确度。将该方法应用于实际禽蛋样品的检测，达到了良好的检测结果，可满足市售禽蛋及制品中多种农药残留的高通量快速检测。

表5 42种农药线性方程、线性平方相关系数、检出限、定量限及线性范围

表6 42种农药精密度及添加回收率(n=6)

续表6

序号名称添加量5 μg/kg添加量10 μg/kg添加量50 μg/kg回收率/%RSD/%回收率/%RSD/%回收率/%RSD/%4毒死蜱75.653.1780.899.3490.375.205苯醚甲环唑95.776.03100.645.50101.6011.686烯酰吗啉95.023.9798.585.20103.561.377甲氨基阿维菌素苯甲酸盐104.853.61109.004.47108.741.428甲氰菊酯77.383.9379.846.7988.874.799氟虫腈103.032.13113.222.55111.002.0210氟甲腈102.851.99110.254.64107.612.1311氟虫腈硫醚(亚砜)103.892.63110.863.52110.441.4312氟虫腈砜100.461.36108.514.06107.411.2413吡虫啉97.735.4794.673.8995.136.0314辛硫磷93.937.81103.967.64103.872.2515哒螨灵82.263.6085.996.0091.313.0216嘧霉胺88.684.5790.213.8696.593.7217胺菊酯88.563.4898.665.5197.3652.9318三环唑83.482.1092.164.26103.462.4619抑霉唑89.694.7592.524.1994.825.4220三唑酮96.552.98105.233.07106.013.0321戊唑醇96.575.0992.426.0399.392.4722克百威97.682.10105.776.68104.102.82233-羟基克百威97.155.24101.791.2299.301.8224多菌灵93.132.8995.492.7999.742.3325灭幼脲90.833.7995.242.7999.762.9726氟啶脲83.0114.2989.235.4791.394.1827二嗪磷95.047.27102.004.64101.731.8528敌敌畏95.434.1396.802.35103.102.5529乙霉威97.620.98103.404.10100.311.2630除虫脲103.015.73111.592.52103.812.7731乐果98.204.3994.532.73103.802.4932水胺硫磷90.857.03103.933.81101.722.63.33马拉硫磷92.764.7495.933.31104.212.2234灭多威100.936.4297.003.8798.703.6135咪鲜胺85.377.5595.297.25100.503.0836丙溴磷88.315.3995.915.2897.035.2137氟胺氰菊酯74.132.7076.778.3881.853.6138噻虫嗪94.512.0194.203.3298.533.9439三唑磷100.472.04105.735.09102.241.6740甲基对硫磷95.366.1698.063.24102.822.3141噻嗪酮88.232.1495.374.5698.353.6642甲萘威91.853.7395.765.29100.832.63

表7 蛋粉农药检测结果