黄芪多糖对脾虚湿困大鼠内分泌、免疫相关因子的影响

赵文晓 季旭明 王媛

摘要 目的：研究黄芪多糖对脾虚湿困大鼠内分泌、免疫相关因子的影响，探讨黄芪多糖健脾祛湿机制。方法：高脂低蛋白饮食加力竭游泳法建立脾虚湿困大鼠模型。黄芪多糖干预后观察脾虚湿困大鼠体质量变化，检测血清总蛋白（TP）、球蛋白（GLB）含量变化，ELISA法检测血清垂体腺苷酸环化酶活化肽（PACAP）含量，免疫组化法检测十二指肠组织IL-6、IL-10表达。结果：与模型组比较，黄芪多糖高剂量组大鼠体质量增加（P<0.05）;黄芪多糖中、高剂量组血清TP含量升高（P<0.05）;黄芪多糖低、中、高剂量组GLB水平出现升高（P<0.01），血清PACAP水平降低（P<0.01），十二指肠组织IL-6及IL-10阳性面积百分比降低（P<0.01，P<0.05）。结论：黄芪多糖可调节脾虚湿困大鼠内分泌、免疫系统相关因子进而发挥健脾祛湿功效。

关键词 黄芪多糖;脾虚湿困;健脾祛湿;内分泌免疫;血清蛋白;垂体腺苷酸環化酶激活肽，白细胞介素-6;白细胞介素-10

Abstract Objective：To study effects of astragalus polysaccharides（APS）on endocrine and immune-related factors in rats with dampness stagnancy due to spleen deficiency， and to explore the mechanism of APS in invigorating spleen for eliminating dampness.Methods：Rat model with dampness stagnancy due to spleen deficiency was established by the high fat and low protein diet and exhaustive swimming method.After APS intervention， the change in body weight was observed， changes in serum levels of total protein（TP）and globulin（GLB）were determined， the content of pituitary adenylate cyclase activating peptide（PACAP）was determined by the ELISA method， and expressions of IL-6 and IL-10 in the duodenum were measured by an immunohistochemical method.Results：Compared with model group， the rats′ body weights in high dose APS group were increased（P<0.05）; the serum TP levels in medium and high dose APS groups were increased（P<0.05）; the GLB levels in the low， medium and high dose APS groups were increased（P<0.01）， the serum PACAP levels were decreased（P<0.01）， and positive area percentages of IL-6 and IL-10 in the duodenum were decreased（P<0.01， P<0.05）.Conclusion：APS can regulate endocrine and immune-related factors in rats with dampness stagnancy due to spleen deficiency to exert the effects of invigorating spleen for eliminating dampness.

Keywords Astragalus polysaccharides; Dampness stagnancy due to spleen deficiency; Invigorating spleen for eliminating dampness; Endocrine and immune; Serum protein; Pituitary adenylate cyclase activating peptide; Interleukin-6; Interleukin-10

中图分类号：R242文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.03.018

黄芪是豆科多年生草本植物蒙古黄芪或膜荚黄芪干燥根，性温味甘，归脾、肺经，具有补气升阳、益卫固表、利水消肿等功效[1-2]。黄芪多糖是黄芪主要活性成分之一，可以调节免疫、抗炎、抗氧化，在防治糖尿病、肿瘤、神经性疾病等方面具有一定作用[3-4]。我们前期研究发现黄芪及其拆分组分可改善脾虚湿困大鼠一般状况，黄芪多糖效果最好[5]。本实验将从内分泌、免疫调节角度，探讨黄芪多糖改善脾虚湿困的机制，为脾虚湿困的机制研究及黄芪多糖临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级Wistar大鼠，48只，雌雄各半，4周龄，体质量100～120 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证编号：SCXK（京）2014-0004。大鼠在IVC独立送回风净化笼中饲养。

1.1.2 药物 黄芪生药材购自山東济南中鲁医院中药房，经山东中医药大学中药鉴定教研室鉴定为黄芪干燥根。参苓白术散（No.20140704）产自山西华康药业有限公司。

1.1.3 试剂与仪器 PACAP试剂盒（No.CK-E95360R）购自上海创祥生物科技有限公司，IL-6（No.GB11117）、IL-10兔多克隆抗体（No.GB13108）购自武汉Servicebio生物;RT-2100型多功能全自动酶标仪（深圳雷杜公司）。

1.2 方法

1.2.1 黄芪多糖制备 2.49 kg黄芪加10倍量水煎煮2次，浓缩，加95%乙醇至含醇量为80%，下层多糖溶解后，过滤上层液，再次醇沉，冷藏过夜。取下层多糖，放-80 ℃冻存，冻干机冻干。经硫酸蒽酮法检测其含量为56.29%。

1.2.2 分组与模型制备 4周龄大鼠适应性饲养3 d后，随机分为模型组和空白组，模型组大鼠按照文献方法[5]，每日给与高脂低蛋白饲料与力竭游泳的方法复制脾虚湿困大鼠模型，连续诱导8周。模型复制成功后，模型大鼠随机分为模型组、参苓白术散组、黄芪多糖低、中、高剂量组。第9周起，

1.2.3 给药方法 按成人临床剂量换算大鼠等效剂量，参苓白术散为2.5 g/kg，黄芪多糖分别为300、600、1 200 mg/（kg·d），1次/d，1 mL/100 g，连续灌胃2周。每天下午观察大鼠一般状况，记录体质量变化。

1.2.4 检测指标与方法

1.2.4.1 血清TP、GLB 大鼠麻醉后，腹腔静脉取血，室温静置后，3 000 r/min离心10 min，获得血清，使用全自动生化分析仪进行TP、GLB检测。

1.2.4.2 血清PACAP 血清PACAP含量严格按照ELISA试剂盒说明书进行操作。

1.2.4.3 十二指肠组织IL-6、IL-10 大鼠麻醉后迅速剪取十二指肠组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，3 μm组织切片脱蜡后，加入一抗，4 ℃孵育过夜，冲洗后加入二抗，室温孵育50 min，PBS冲洗，加入二氨基苯胺（DAB）显色，苏木精复染，脱水，封片。采用Image J软件对阳性染色区进行阳性面积百分比（%Area）。

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析，其中计数资料以（%）表示，采用χ2检验，计量资料以（±s）表示，采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 黄芪多糖对体质量影响

第1周模型复制前各组大鼠体质量差异无统计学意义。第8周模型复制结束时与空白组比较，造模后模型大鼠体质量显著下降（P<0.01）。第10周给药后与模型组比较，黄芪多糖高剂量组和参苓白术散组大鼠体质量显著升高（P<0.01）。见表1。

2.2 黄芪多糖对血清TP、GLB水平的影响

与空白组比较，模型组血清TP及GLB水平下降（P<0.05）。与模型组比较，黄芪多糖中剂量组、高剂量组血清TP水平升高（P<0.05），黄芪多糖低、中、高剂量组血清GLB水平显著增加（P<0.01），参苓白术散组GLB水平升高（P<0.05）。见表2。

2.3 黄芪多糖对血清PACAP水平的影响

与空白组比较，模型组血清PACAP水平显著升高（P<0.01）;与模型组比较，黄芪多糖低、中、高剂量组血清PACAP水平显著降低（P<0.01）。参苓白术散组PACAP水平显著降低（P<0.01）。见表3。

2.4 黄芪多糖对十二指肠组织IL-6、IL-10的影响

与空白组比较，模型组大鼠十二指肠组织IL-6和IL-10阳性面积百分比显著升高（P<0.01）。与模型组比较，黄芪多糖低、中、高剂量组IL-6表达均出现降低（P<0.01），IL-10表达也出现不同程度的降低（P<0.05，P<0.01），参苓白术散组IL-6、IL-10表达降低（P<0.05，P<0.01）。见表4。

3 讨论

中医理论中脾为后天之本，气血生化之源，是以消化系统为主的多系统、多功能综合单位，其功能与消化、血液、内分泌、免疫系统密切相关。若脾失健运，则会引起出现水谷精微运化障碍，表现为消瘦、气血衰少、倦怠、眩晕、水肿等脾虚湿困症状。研究发现，脾气虚证患者内分泌免疫网络相关神经递质、胃肠激素、免疫球蛋白等出现异常[6]。递质、激素及细胞因子等相互联系的递质构成复杂网络调节机体内环境稳定[7]。脾脏通过胃肠道内分泌、免疫网络间相关因子的作用发挥运化、统血等功能。胃肠道存在大量神经元、内分泌及免疫细胞，成为内分泌、免疫调节网络的重要部位。因此，本研究以胃肠道内分泌、免疫系统中相关因子变化为切入点，使用本课题组依据饮食失节、劳倦伤脾中医理论建立的脾虚湿困动物模型，研究黄芪多糖健脾祛湿的作用机制。

黄芪是一味补气扶正要药。《中华人民共和国药典》明列黄芪具有“扶正固本、补中益气”的功效。据报道黄芪对内分泌、免疫系统均有广泛的作用[8]。黄芪多糖使其主要活性物质之一，对内分泌、免疫系统同样具有广泛作用。本实验结果显示，黄芪多糖可增加体质量及血清蛋白水平，我们推测黄芪多糖通过脾虚湿困大鼠的内分泌、免疫网络从而增加体质量，增强免疫功能等，发挥健脾祛湿功效。

本实验结果显示，脾虚湿困大鼠血清PACAP显著升高。PACAP是一种具有广泛活性的内分泌多肽，主要分布于中枢神经系统、消化系统、内分泌系统等神经纤维中，是神经-内分泌-免疫系统共同的化学信号分子之一，可通过肠道神经系统调节水盐吸收和分泌，降低摄食量、胃酸分泌等[14-15]。此外，还在免疫和抗炎中发挥重要作用。PACAP38可以刺激元代培养的大鼠垂体前叶细胞释放IL-6，同时还可以增加IL-10基因表达[16]。因此，本实验结果模型大鼠PACAP水平升高提示机体内分泌及免疫系统失调，食物消化、水液代谢及免疫等代谢异常，黄芪多糖通过降低PACAP水平从而改善脾虚湿困时机体消化吸收、水液潴留、免疫低下等状况。

我们还发现，脾虚湿困大鼠十二指肠组织IL-6和IL-10水平升高。IL-6主要由单核巨噬细胞、淋巴样细胞等产生，是一种多效应细胞因子，在免疫应答、造血调节、内分泌系统中发挥重要作用，还可减少白蛋白、转铁蛋白等多种蛋白表达，控制B细胞，调节IL-10分泌等[9]。正常机体血清IL-6浓度相对较低，当疾病发生时IL-6浓度急速升高。IL-10是多细胞分泌的多效价细胞因子，免疫细胞和中枢神经细胞均可分泌。研究发现，脾虚患者IL-6水平及基因表达增加，脾虚大鼠脑内IL-6受体、IL-10水平及基因表达增加[10-13]，与本实验结果相一致。因此本实验结果提示，黄芪多糖通过调节脾虚湿困大鼠IL-6、IL-10水平，进而增强机体免疫，调节内分泌等系统，以改善脾虚湿困症状。

总之，黄芪多糖可通过调节内分泌、免疫网络中PACAP、IL-6、IL-10水平，进而增加体质量，促进消化吸收，增强机体免疫，调控机体内环境稳定，从而改善机体脾虚湿困状态，发挥健脾祛湿的功效。

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（2018-11-03收稿 责任编辑：徐颖）