原人参二醇纳米混悬液体外含量测定及冻干保护剂的研究

陈晨，孙倩

原人参二醇纳米混悬液体外含量测定及冻干保护剂的研究

陈晨，孙倩

（辽宁医药职业学院， 辽宁 沈阳 110101）

20（S）-原人参二醇作为研究对象，用反溶剂沉淀法制备20（S）-原人参二醇纳米混悬液。通过优化液相的条件，本章建立了原人参二醇HPLC的体外分析方法，确定了乙腈∶水（/）=90∶10（/）作为流动相，波长 210 nm 的液相条件。对标准曲线，精密度和准确度的考察结果显示：原人参二醇在23.08~1 154 μg/mL范围内线性良好，日内、日间精密度RSD值小于3%，准确度在96%~103%之间，加样回收率为100.84%，该方法满足体外检测原人参二醇定量的要求。考察冻干保护剂，最后确定为1.5%的羟丙基-β-环糊精。

原人参二醇； 含量测定； 冻干保护剂

人参是五加科植物人参属人参的干燥根茎，在我国应用历史悠久，最早记录于我国传统医学专著《神农百草经》[1, 2]。人参中有多种有效的化学成分，如皂苷、氨基酸挥发油及多糖等，其中人参皂苷类是人参的主要活性成分[3]。人参皂苷主要分以下三类[4, 5]：（1）、原人参二醇型，有Rb1, Rb2, Rb3, Rc,等；（2）、原人参三醇型，有R1, R2, R3, Rg等；（3）、齐墩果酸型，有Ro, Rh3, Ri等。研究表明，在胃肠道中，人参皂苷代谢成苷元或次苷元更好的表达药理活性。

近年来，难溶性药物原人参二醇（PPD）由于其抗肿瘤活性[6-8]和抗疲劳[9]，抗抑郁[10]等脑内活性近年来成为研究的热点，但其溶解性差，生物利用度低限制其脑内活性的研究。据统计，约70%的有较强药理活性的候选药物由于水溶性差导致研发被迫中止[11]。现今已有很多方法解决难溶药的溶解度问题，如添加增溶剂，形成包合物或络合物等，但是这些技术局限于某些结构的化合物，如环糊精包合物需要分子大小与其中间的环状结构契合。而把药物制成纳米晶混悬液是一种适合难溶药制剂开发的新技术，纳米晶具有载药量为100 %，没有纳米粒聚合物载体材料[12]，可提高药物的溶解度，进而提高药物的生物利用度等优点。因此，可以通过制剂化手段改善PPD的生物利用度来提高其血药浓度，针对PPD的理化性质，纳米晶体混悬液给药系统可望解决以上问题。

作者利用高效液相色谱法测定纳米混悬液体外含量。实验结果表明 ,该方法重复性良好，方便快捷。为日后20（S）-原人参二醇纳米混悬液制剂的含量测定、质量控制提供了依据。

1 仪器与试料

高效液相色谱仪（Agilent 1200 Series）由四元泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱、二极管数组检测器组成（Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA）；Zorbax SB-C18 色谱柱（4.6×250 mm, 5 μm，Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, CA, USA）；恒温磁力搅拌器（上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司，中国）； Nano-Zetasizer 动态光粒径测定仪（Malvern，UK）；EL204-IC 电子天平（瑞 士 Mettler Toledo 公司）；Allegra X-15R 离心机（Beckman，USA）；冷冻干燥机（Coolsafe 110，Scanlaf，Denmerk）；

原人参二醇 （纯度>98%,成都普菲尔生物技术有限公司），甲醇，乙腈（Merk，Germany）；维生素E聚乙二醇琥珀酸酯TPGS （Sigma-Aldrich）；丙酮购于天津凯通化学试剂公司；超纯水。

2 实验方法

2.1 原人参二醇纳米混悬液的制备

精密称取5 mg PPD溶解于1 mL丙酮中，在1 000 r/min条件下，注入到10 mL含0.015%（/）TPGS水相中，继续高速搅拌5 min，超滤法除有机溶剂，高速离心25 min，用等体积超纯水复溶，得到样品PPD纳米晶混悬液。

2.2 测定波长的选择

配置PPD甲醇溶液200 μg/mL, 通过HPLC 1200 全波长扫描，确定高效液相色谱法中PPD的测定波长。

2.3 流动相的优化

色谱柱：Zorbax SB-C18（250×4.6 mm, 5μm, Agilent）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样体积：20 μL；检测波长：210 nm；流动相：待优化。

2.4 标准曲线的绘制

精密称定5.77 mg PPD样品，甲醇溶解定容与5 mL 容量瓶中，得到浓度为1154 μg/mL 的PPD储备液。分别用移液管精密量取储备液，甲醇对半稀释，得到 1 154, 577，288.5，115.4，57.7，23.08μg/mL的标准液。按照2.2项下优化的色谱条件进样，PPD标准液的浓度（μg/mL）为横坐标，HPLC峰面积为纵坐标，进行线性回归，考察浓度与峰面积的线性关系。

图1 PPD的全波长扫描图

2.5 精密度和准确度考察

分别取线性范围内的23.08, 284.48, 1 154 μg/mL高、中、低3个浓度的标准液，一天之内连续进样5次，连续进样3天，HPLC测定样品。将峰面积带入标准曲线，计算相应的标准液浓度，并与实际浓度进行比较，从而计算准确度，并且，以PPD测定浓度的相对标准偏差（RSD）评价日内与日间精密度。

2.6 稳定性试验

精密吸取“2.3”项下任意浓度作为供试品溶液，放置24 h，每隔2 h按照2.2项下优化的色谱条件进样3次，计算平均峰面积。

2.7 加样回收率试验

取已制备的PPD纳米混悬液1 mL（约含PPD 0.5 mg），分别加入80%，100%，120% 已配制完的PPD对照品溶液（0.512 4 mg/mL），按照2.2项下优化的色谱条件依次进样，平行测定3次，计算样品中含量。

2.8 原人参二醇纳米混悬液的冻干与重分散试验

取已制备完的 0.4 mg/mL 的 PPD 纳米晶混悬液，加入不同种类与浓度的冻干保护剂。样品搅拌加入冻干保护剂溶解后，放入-80 ºC 冰箱中预冻 12 h 以上， 后移入冷冻干燥机中冻干48 h以上，确保全部成为冻干粉。将冻干粉溶解于一定量超纯水中获得重分散体系。测定重分散后的混悬液的粒径和 PdI，筛选 出具有良好分散性的冻干保护剂。冻干 PPD 纳米晶混悬液候选保护剂如表1所示。

表1 不同种类冻干保护剂的浓度

3 结果与讨论

3.1 测定波长的选择

由HPLC1200得到原人参二醇在210~400 nm的全波长扫描图，如图1所示。

原人参二醇甲醇溶液在210 nm处有最大吸收，所以选择210 nm作为HPLC方法中的检测波长。

3.2 流动相的优化

调节乙腈与水的比例，得到的色谱结果如表2所示。实验结果表明，随着乙腈比例的增加，PPD的保留时间减小。为缩短分析时间，流动相比例确定为乙腈∶水（/）=90∶10 （/）。

表2 HPLC流动相比例优化

3.3 标准曲线的绘制

将PPD的浓度与对应的HPLC积分所得峰面积进行线性回归，得到的回归方程为：

=4.813 5-25.593（2=0.999 9）

式中：—积分所得峰面积；

—PPD浓度。

在23.08~1 154 μg/mL范围内线性良好，标准曲线见图2。

3.4 精密度和准确度的考察

该检测方法高、中、低浓度准确度以及日内、日间准确度如表3。结果表明，日内、日间精密度的RSD值均小于3%, 准确度在96%~103%之间，说明所建立的高效液相色谱方法的精密度和准确度均良好。

图2 PPD的标准曲线

表3 PPD的日间和日内准确度和精密度

3.5 稳定性试验

结果表明，24 h内测定的RSD值为1.45%, 说明PPD甲醇溶液稳定性良好。

3.6 加样回收率试验

该检测方法测定加样回收实验如表4。结果表明，加样回收率为100.84%，RSD值＜3%，说明该高效液相色谱法的准确度良好。

表4 PPD的加样回收率试验

3.7 原人参二醇纳米混悬液的冻干与重分散试验

从实验结果可见，冻干保护剂对PPD纳米混悬液的冻干后重分散的影响不同。当加入乳糖和糊精在PPD纳米混悬液冻干重分散时，有明显沉降发生，无法复溶。当使用不同浓度的葡糖、D-海藻糖和0.5% 羟丙基-β-环糊精时，虽然可以使PPD纳米混悬液重新分散，但是粒径较大，且不均一。当使用1.5%和5%浓度的羟丙基-β-环糊精时，复溶后，粒径没有明显变化，且PdI<0.3，体系较均一。在加入5%的羟丙基-β-环糊精时，由于浓度较高，在水中搅拌溶解时间较长。根据上述结果，因此最后确定以1.5%的羟丙基-β-环糊精作为PPD纳米混悬液的冻干保护剂。

4 讨论

本文曾以210 nm为波长，不同比例甲醇∶水作为流动相优化色谱条件，甲醇∶水=70∶30时，保留时间为29 min；甲醇∶水=80∶20时，保留时间为25 min；甲醇∶水=90∶10时，保留时间为18 min。尝试用乙腈∶水作为流动相梯度洗脱，但是由于其基线不稳，漂移且出现平峰、拖尾等问题，而最终选择以乙腈∶水=90∶10作为流动相，流速1 mL/min，效果较好。

［1］ Liu, C.X. and P.G. Xiao, Recent advances on ginseng research in China[J]., 1992，36（1）: 27-38．

［2］张均田. 人参研究的最新进展[J]. 江苏大学学报（医学版）, 2009, 19（03）: 185-191．

［3］Kitts, D. and C. Hu, Efficacy and safety of ginseng[J]., 2000, 3（4A）: 473-85．

［4］Choi, K.T., Botanical characteristics, pharmacological effects and medicinal components of Korean Panax ginseng C A Meyer[J]., 2008, 29（9）: 1109-18.

［5］张静静, 刘桂芹, 王庆鹏，李兰杰. 植物三七中皂苷类化学成分的研究进展[J]. 聊城大学学报（自然科学版）, 2018, 31（02）: 43-52+59．

［6］Liu, G.Y., et al., 20S-protopanaxadiol-induced programmed cell death in glioma cells through caspase-dependent and -independent pathways[J]., 2007, 70（2）: 259-64.

［7］Zhang, Z., et al., TRAIL pathway is associated with inhibition of colon cancer by protopanaxadiol[J]., 2015, 127 （1）: 83-91．

［8］Zhu, G.Y., et al., 20（S）-Protopanaxadiol, a metabolite of ginsenosides, induced cell apoptosis through endoplasmic reticulum stress in human hepatocarcinoma HepG2 cells[J]., 2011, 668（1-2）: 88-98.

［9］Oh, H.A., et al., Anti-fatigue Effects of 20（S）-Protopanaxadiol and 20（S）-Protopanaxatriol in Mice[J]., 2015, 38（9）: 1415-9.

［10］Xu, H., et al., Protective effect of Panax quinquefolium 20（S）-protopanaxadiol saponins, isolated from Pana quinquefolium, on permanent focal cerebral ischemic injury in rats[J]., 2014, 7（1）: 165-170．

［11］Cooper, E.R., Nanoparticles: a personal experience for formulating poorly water soluble drugs[J]., 2010,141: 300-302.

［12］Junghanns, J.-U.A., M Li, S.L., Sun, E., Tan, X.B., Sechnology, drug delivery and clinical applications[J]., 3, 295.

Study on Determination of the In Vitro Content of Protopanaxadiol Nanosuspension and Its Lyophilized Protective Agent

,

（Liaoning Vocational College of Medicine, Liaoning Shenyang 113001, China）

Using 20 (S) -protopanaxadiol as research object, 20 (S) -protopanaxadiol nanosuspension was prepared by anti-solvent precipitation.An in vitro analytical method of protopanaxadiol by HPLC was established, and the liquid phase conditions were optimized as follows: the mobile phase acetonitrile and water(acetonitrile∶water=90∶10),the wavelength 210 nm.The standard curve, precision and accuracy were investigated. The results showed that the protopanaxadiol had good linearity in the range of 23.08~1 154 μg/mL,intra-day and inter-day precision RSD values were less than 3%,the accuracy was between 96%~103%, and the recovery rate was 100.84%.This method met the requirements for the in vitro determination of protopanaxadiol.At last,its lyophilized protective agents were screened, and 1.5% hydroxypropyl-β-cyclodextrin was finally determined as suitable lyophilized protective agent.

protopanaxadiol; content determination; lyophilized protective agent

2019-11-18

陈晨（1990-），女，助教，硕士，辽宁省沈阳市人，2016年毕业于澳门大学中药学专业，研究方向：药物分析。

孙倩（1985-），女，讲师，硕士，研究方向：药物分析。

O 657

A

1004-0935（2020）02-0140-04