精液冻存时间对精液质量及受孕能力的影响*

王奇玲 张欣 宗** 唐 运革 钟恺欣 马春 杰 陈 曦

1. 国家卫生健康委员会男性生殖与遗传重点实验室（广州510600）2. 广东省计划生育科学技术研究所男性科；3. 广东省计划生育专科医院人类精子库

人精子低温冷冻保存技术常规应用于人类精子库， 主要用于供精者捐精精液及有生殖保险需要的自身精液的冷冻保存[1]。 由于冷冻过程会形成冰晶及引起渗透压的改变，诱发氧化应激并产生过量活性氧，对精子产生氧化损伤， 引起精子功能受损以及精子核和精子DNA 受损[2]。 精液冷冻过程中产生的过多活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）引起质膜多不饱和脂肪酸减少， 使膜的液态性、 流动性及通透性发生改变，造成精子的完整性和运动性被不可逆地破坏，使其质量降低，受精率下降[3]。 为减少冷冻损伤，精液冷冻方法及冷冻保护剂的选择至关重要。如果精液冷冻保存方法合适，精子质量不会随着冻存时间的延长而下降。 有研究报道冷冻保存超过28 年的精子仍能生育子代[4]。国内相关研究报道较少。 随着二孩政策的全面实施，之前通过供精人工授精生育首次生育的部分夫妇使用同一供精精液号进行再次生育。 针对相同供精者的精液，再次生育时精液冷冻保存的时间较首次生育时的精液更长。 我们汇总统计了广东省人类精子库部分精液使用随访信息， 分析供精精液不同冻存时间复苏后的精液质量及受孕能力，现将结果报告如下。

资料与方法

一、研究资料

自再次生育政策实施以来， 本院生殖中心使用广东省人类精子库供精精液进行人工授精治疗，共有280对人工授精夫妇使用之前首次生育时使用的供精冷冻精液进行再次生育。 截至2018 年9 月累计进行541 个周期。 汇总这些夫妇在首次生育和再次生育时所用精液的相关随访资料。 541 个再次生育手术周期中，有42个手术周期采用与首次生育精液相同采集日期， 其余再次生育手术周期所用精液的采集日期与首次生育精液采集日期相差在3 个月之内。

二、研究指标

精液质量采用以下3 个指标评估： 复苏后精子浓度（106/m L）；复苏后前向运动精子百分比（%）；复苏后前向运动精子总数（106）。 再次生育使用精液与首次生育使用精液的不同冻存时间采用冻存时间差（再次生育与首次生育手术周期的时间差，按年计）评估；精液的受孕能力采用周期妊娠率（再次生育时使用与首次生育相同供精者精液的全部人工授精周期中， 怀孕周期数/总的周期数，%）评估。

三、研究方法

怀孕信息均由生殖中心以B 超或血HCG 检测结果确认。 精子浓度和前向运动精子百分比的计数均按照《WHO laboratory manual for the Exam ination and Processing of human semen》（第五版）[4]进行分析。前向运动精子总数为精液量、精子浓度、前向运动精子百分比3个指标的乘积。

四、统计方法

所有数据分析用SPSS19.0 软件完成。描述性分析再次生育所用精液较首次生育受孕精液的冻存时间差。 再次生育与首次生育手术周期的复苏后精子浓度、 复苏后前向运动精子百分比、 复苏后前向运动精子总数的比较采用配对T 检验进行分析。 计算周期妊娠率，周期妊娠率的比较采用卡方检验。P＜0.05 代表差异有统计学意义。

结 果

一、精液冻存时间差

541 个手术周期，再次生育精液与首次生育精液冻存时间差最小1.70 年，最大10.84 年，平均相差（5.10±2.04）年。

二、复苏后的精液质量

再次生育与首次生育精液复苏后各参数结果如表1 所示。 再次生育精液复苏后精子浓度略高于首次生育精液，差异无统计学意义；前向运动精子百分比再次生育精液低于首次生育精液，差异有统计学意义；前向运动精子总数再次生育精液略低于首次生育精液，差异有统计学意义。

表1 供精再次生育精液与首次生育精液复苏后的精液质量比较

再次生育手术周期采用的精液与首次生育手术周期采用的精液是同一天采集的，42 个周期精液复苏后各参数结果如表2 所示。 再次生育精液与首次生育精液相比，复苏后精子浓度、前向运动精子总数差异无统计学意义。 再次生育精液的复苏后前向运动精子百分比低于首次生育精液，差异有统计学意义。

表2 42 个再次生育周期与首次生育周期使用同一天采集的精液复苏后精液质量的比较

三、冻存时间与精液质量的关系

冻存时间再次生育精液复苏后前向运动精子百分比低于首次生育精液， 再次生育精液与首次生育精液的冻存时间差与前向运动精子百分比差的相关性无统计学意义（r=0.188，P=0.233）。 随着冻存时间的延长，精液的前向运动精子百分比有下降， 但下降的幅度与冻存时间的长短无关。

四、长时间冻存后精液的受孕能力

本研究280 对夫妇接受了541 周期的人工授精手术，其中有113 对夫妇如愿怀孕再次生育，周期妊娠率为20.9%， 与同期该生殖中心的周期妊娠率21.49%（873/4063）相比，差异无统计学意义（χ2=0.1019，P=0.7496）。

讨 论

随着辅助生殖技术成为解决人类生育难题的重要手段， 精子冷冻保存技术在人类辅助生殖技术的发展中发挥越来越重要的作用。 冷冻过程中产生过多的ROS 使人精子受到氧化损伤， 复苏后的精子其活力和受精率通常低于新鲜精液[3]。 有研究报道，精子冻融过程中产生的过量ROS 可能导致精子头部顶体脱落、破损、内含物丢失，阻碍精卵结合，从而影响精子的受精功能[5]。 冷冻精子的顶体穿透试验研究结果提示冷冻保存对顶体造成损伤，但精子仍能保持活性，顶体素可能未受影响，精子仍具备正常的穿透能力[6]。 来自日本的研究报道冷冻精子和新鲜精子相比受精能力并无明显下降[7]。 本研究结果提示，再次生育精液的周期妊娠率为20.9%，与首次生育精液（使用同期的）的周期妊娠率相比，差异无统计学意义。 精液冻存时间的延长没有降低这些精液的受孕能力。

有研究报道， 冷冻后精子活力的下降与冻存时间有非线性的关系，冷冻6 个月后的精子，复苏后其活力下降的趋势基本停止，保留在一定的活力水平[8]。 这是由于精子的代谢活动适应了冷冻环境并达到新的平衡， 精子长期冷冻保存后仍具有活力。 本研究结果提示， 精液冻存时间的延长可能使复苏后的前向运动精子百分比降低， 但这种降低对精子的受孕能力没有显著影响。 另一方面，这些长时间冻存的精液在保存过程中由于日常工作中其他精液的移罐、 出库等操作可能暴露于空气中，如果操作不规范，暴露时间过长也可能影响精液复苏后的活力。

史雅萍等[9]汇总统计，2204 个供精人工授精周期使用的供精精液复苏后的精液参数与周期妊娠率的关系， 研究结果提示了复苏后精子的活力及前向运动精子总数不会影响周期妊娠率，这与精液来源于供精，精液参数已在规定范围内有关。朱丹丹等[10]对269 个人工授精周期的统计结果表明， 处理后前向运动精子总数对人工授精结局有影响， 当前向运动精子总数低于5×106时，临床妊娠率显著下降。 本研究结果提示，随着冻存时间的延长， 复苏后的前向运动精子总数没有显著降低，冷冻精液的周期妊娠率没有受到影响。

总而言之，随着冻存时间的延长，精子库冻存的精液其精子活力虽有降低，但不影响其临床受孕能力。 精子库冷冻精液的质量及使用是有保障的。