棉花高效嫁接新方法及其应用研究

秦丽霞，张换样，李静，朱永红，聂园军，焦改丽，吴慎杰*

（1.山西省农业科学院棉花研究所，山西运城044000；2.山西省农业科学院资源与经济研究所，山西太原030031）

棉花作为重要的资源性农产品在国民经济中起着至关重要的作用[1]。 基因工程和细胞工程是当今棉花遗传改良育种的重要手段，棉花组培再生植株是转基因技术在棉花遗传改良应用的基础，但通过体细胞胚胎发生获得的转基因再生棉株试管苗根系大多发育不良，表现为无根苗、褐根苗和畸形苗（如丛生苗）等，根系正常的再生植株移栽至土壤或蛭石中，成活率极低（通常只有10%～20%），生长缓慢，极大地限制了棉花遗传改良技术的应用[2]。嫁接体系的建立和完善有利于大规模保存繁育遗传分离群体、常规棉株以及稀有种质资源，有利于加快现代生物技术在棉花遗传改良上的广泛应用、加快转基因棉花的育种进程[2-11]。

嫁接作为一种实用技术在果树、蔬菜等植物的繁育、增产、抗逆性提高等方面应用广泛[12]。王伟等[2]首次报道用劈接法嫁接解决转基因棉花再生植株定植困难的问题，研究表明嫁接可以挽救一些利用移栽方法无法成活的幼苗， 极大地提高了成活率，亦可为研究组织培养中的变异问题（如染色体畸变等）保存宝贵的材料。 李燕娥等[3-4]进一步研究了转基因棉花的嫁接， 涉及到了影响嫁接的一些因素，如及时松绑、逐步放风、浇水适量等。 张寒霜等[5]用棉花组培苗嫁接，在花盆上覆膜保湿，提出嫁接接穗长度、去绳时间等影响成活率。吴慎杰等[6]首次将插皮接法引入棉花嫁接，用塑料瓶保湿，并研究了适宜嫁接的苗龄， 得出砧木3～5 片真叶劈接法效果较好，此后用插皮接法成活率高，适用范围较广。王彦霞等[7]用合接法嫁接棉苗，并以顶插接法、劈接法做对照，研究了砧木接穗不同品系不同苗龄间的配合，用烧杯倒扣保湿，得出接穗1 叶1 心、砧木1～3 片真叶嫁接效果最好， 同品种或相近品种嫁接成活率高的结论。此外，Luo 等[8]采用改进后的劈接法进行离体茎尖植株嫁接均取得较好效果，嫁接棉株生长势强，生长发育快，能够提早开花，提早成熟，且未发现与嫁接有关的不利影响。 黄双领等[9-10]选择根系发达、抗病强的海岛棉作为砧木，将海、陆棉进行嫁接克服远缘杂交的困难，缩短有性杂交育种周期，提高产量和品质及抗病性。 张大伟等[11]采用嵌合法进行棉花嫁接，并与合接法、插皮接法、劈接法分别作嫁接比较试验、砧木和接穗配合试验和不同嫁接时期比较试验，表明嵌合法增加砧木与接穗间接触面，砧木与接穗相对交错嵌合，咬合牢实、固定较好，减少了砧穗间接触面组织的破坏，嫁接棉苗成活率有所提高。

采用合接法、劈接法、插皮接法和嵌合法进行棉花嫁接，一定程度上提高了棉株的成活率。 但是对于再生植株嫁接来说存在以下弊端：常规“劈接法”贴着子叶柄摘头去心，切口垂直于子叶柄，子叶会因重力作用向两边耷拉， 接穗插入固定较为困难。 也有一些研究人员在子叶柄上端留一段上胚轴，纵向剖开，然而此方法不便于砧木叶片供给接穗营养。 插皮接法需要的砧木较大。 合接法其形成层接触面较少， 砧木与接穗体内营养物质交换较少。 嵌合法操作比较繁琐，且只适合砧木与接穗苗龄大小相近的植株。以上几种嫁接方法对温度和湿度的要求也比较高。 因此，棉花高效嫁接技术仍有待深入系统研究，完善的棉花嫁接技术体系也有待建立。

本研究建立了一种新的高效棉花嫁接技术体系，嫁接成活率可稳定在92%以上，在适宜的砧木与接穗配合期嫁接成活率可达到100%， 该方法操作简便、嫁接速度快、成活率高，且可以广泛应用于多种双子叶植物幼苗和幼嫩枝条的嫁接。

1 材料与方法

1.1 材料的准备

1.1.1海岛棉作砧木，组培苗作接穗。选用根系发达、 抗枯、 黄萎病性强的海岛棉品种海7124 作砧木， 组培室培养间组培苗作接穗。 2017 年1 月5日、3 月15 日在山西省农业科学院棉花研究所温室（27～33 ℃）分别种植砧木 200 盆和 500 盆，5 月17 日、8 月 20 日在室外网棚（30～38 ℃）分别种植砧木各200 盆，每盆2～3 株，待子叶完全展开，每盆留1 株生长较为健壮的植株。

1.1.2黑籽南瓜作砧木，黄瓜苗作接穗。早春季节，分别在营养钵中播种盆栽黑籽南瓜和黄瓜各50盆，每盆2～3 株，待子叶完全展开，每盆留1 株生长较为健壮的植株。待南瓜苗长出1～2 片真叶，且第1 片真叶长至1 cm 长度左右时，即可作为砧木。播种后约10 d 左右，黄瓜苗子叶展平，长出1 片真叶和生长点，即可作为接穗。

1.1.3印度南瓜作砧木，甜瓜作接穗。在营养钵中播种盆栽印度南瓜（笋瓜）和甜瓜（新玉美人）各50盆，每盆2～3 株，置于温室大棚中。 待子叶完全展开，每盆留1 株生长较为健壮的植株。 印度南瓜比甜瓜提前1 周种植。 待印度南瓜苗长出1～2 片真叶且第1 片真叶出展 （即破心）、2 片子叶充分展平，苗高6～8 cm、茎未中空时，即可作为砧木。 甜瓜子叶展平第1 片真叶露头即破心后， 即可作为接穗。

1.1.4瓠葫芦作砧木，西瓜幼嫩枝条作接穗。分别在营养钵中播种盆栽瓠葫芦和西瓜 （夏宝） 各50盆，每盆2～3 株，置于温室大棚中。 待子叶完全展开，每盆留1 株生长较为健壮的植株。 瓠葫芦比西瓜提前10 d 播种，瓠葫芦的真叶出现时，即把顶芽摘除， 待其长出2～3 片真叶、2 片子叶充分展平时，即可作为砧木。待西瓜子叶展平，第1 片真叶露头即破心后，即可作为接穗。

1.2 方法

1.2.1“Y 型”劈接法在棉花嫁接中的应用。（1）在嫁接前1 d，将种植在花盆中的海岛棉7124 砧木浇足水分。对生长有1～3 片真叶的砧木，仅保留砧木2 片子叶，切去2 片子叶以上部位茎叶；对生长有4～6 片真叶的砧木，保留砧木2 片子叶和1～2 片真叶，切去上部茎叶，然后从子叶叶柄/ 真叶叶柄下缘的5 mm 处开始，手术刀片沿叶柄中轴和茎中轴自上而下穿过叶柄下段和茎杆从中间纵向剖开，叶柄下缘的切口0.5 cm，茎段切口长1.5～2 cm，叶柄与茎的整个切口呈 Y 型，如图 1A、1D。 （2）保留接穗顶端2～4 片幼嫩真叶和生长点， 长度3～5 cm，在接穗的茎秆下段两边各削1 刀，削尖，削面呈“V”字型，削面长 1～1.5 cm（图 1B）。 （3）将接穗的茎段垂直插入砧木的切口中，利用叶柄下段切口的自然夹力将接穗和砧木紧密结合在一起（图1C，1E），用塑料绳缠绕或夹子稍加固定。 （4）用塑料薄膜严密包裹整盆植株，5―9 月（晴天超过28 ℃时）在室外网棚环境中需要50%～75%的遮阳网在顶部遮阳，10 至翌年4 月底在正常管理的温室环境中即可，不需要遮阳。 （5）待嫁接植株渡过缓苗期，从接穗叶片恢复平展（6―7 d）开始逐渐用铅笔（直径7～8 mm）在包裹植株的塑料薄膜顶上打孔放风透气去湿，两天1 次，每次打3 个孔，观察到接穗有明显的新叶长出和伸长（14―17 d）时开始揭膜、去除固定物，即完成嫁接，继续炼苗1 周后移栽到大盆或田间。

1.2.2不同嫁接时期的比较试验。分别对1 月5日、3 月 15 日、5 月 17 日、8 月 20 日不同批次种植的砧木选择在棉苗的 1 叶 1 心、3 叶 1 心、4 叶 1 心和 6 叶 1 心 4 个生育时期，利用“Y 型”劈接法进行嫁接试验，统计分析接穗的成活率，选择最佳的嫁接时期。

图1 “Y 型”劈接法嫁接示意图

1.2.3“Y 型”劈接法嫁接比较试验。在海岛棉棉苗生长至4 叶1 心时， 分别用前人已报道的合接法、常规劈接法、插皮接法、贴接法、切接法和嵌合法做对照，比较“Y 型”劈接法嫁接试验，统计不同嫁接法的接穗成活率并测量接穗月生长量。劈接法参照文献[2-5]，插皮接法参照文献[6]，合接法参照文献[7]，嵌合法参照文献[11]，贴接法和切接法参照文献[13]。

1.2.4“Y 型”劈接法在其他双子叶植物中的应用研究。采用“Y 型”劈接法在2 叶1 心时期的黑籽南瓜上嫁接黄瓜幼苗，在1 叶1 心时期的印度南瓜上嫁接甜瓜幼苗，在3 叶1 心时期的瓠葫芦上嫁接西瓜幼嫩枝条，随后分别统计其嫁接成活率。

2 结果

2.1 “Y型”劈接法在不同嫁接时期的比较

分别在 1 月 5 日（冬季）、3 月 15 日（春季）、5月 17 日（初夏）、8 月 20 日（秋季）种植海 7124 作为砧木，组培棉苗为接穗。 用“Y 型”劈接法在砧木生长的不同时期 （1 叶 1 心、3 叶 1 心、4 叶 1 心、6叶1 心）进行嫁接比较试验。试验结果表明：不同季节无论是在温室还是室外嫁接，采用“Y 型”劈接法的棉苗成活率均无显著差异，均有92%以上的成活率（表 1）。 另外，在砧木生长的不同时期中，1 叶 1心、3 叶 1 心、4 叶 1 心和 6 叶 1 心时嫁接棉苗成活率分别为97.56%～100%、94.87%～96.49%、93.02%～98.11%和 92.10%～95.45%（表 1）。 结果表明：从1 叶 1 心至 6 叶 1 心时期的砧木苗均适合“Y 型”劈接法嫁接， 且成活率在92.10%以上， 受室内、外温度和湿度环境影响不大。 与先前报道嫁接相比[2-7，11，13]，“Y 型”劈接法砧木可使用时间较长。

2.2 棉苗不同嫁接方法比较

为了选择高效的棉花嫁接方法，采用不同嫁接方法进行比较试验。在砧木棉苗生长至4 叶1 心时期，利用海7142 为砧木、组培苗为接穗，分别用“Y型”劈接法、合接法、常规劈接法、插皮接法、贴接法、切接法和嵌合法7 种嫁接方法进行嫁接。 10 d后统计嫁接成活率。 结果显示：7 种嫁接方法嫁接的棉苗成活率相差很大。 其中，“Y 型”劈接法嫁接的效果最好，嫁接成活率为98.11%；贴接法、合接法、 嵌合法、 切接法依次为 89.13%、86.27%、82.98%、80.77%， 插皮接法的嫁接成活率为78%；常规劈接法嫁接效果最差， 其嫁接成活率只有63.27%（表2）。 以上7 种不同嫁接方法比较试验结果表明，“Y 型”劈接法是棉花最适宜的嫁接方法。

表1 “Y 型”劈接法不同时期棉苗嫁接成活率统计分析

同一时期砧木和相同的嫁接时间，7 种嫁接方法的成活率有显著差异，但接穗的生长速率无显著差异。 接穗月生长量在 （9.43±2.01）～（10.15±1.73） cm 之间（表2）。

2.3 “Y型”劈接法在其他双子叶植物中的应用研究

采用“Y 型”劈接法分别在2 叶 1 心时期的黑籽南瓜上嫁接黄瓜幼苗，在1 叶1 心时期的印度南瓜上嫁接甜瓜幼苗，在3 叶1 心时期的瓠葫芦上嫁接西瓜幼嫩枝条，10 d 后分别统计其成活率。 结果显示：黄瓜、“新玉美人”甜瓜和“夏宝”西瓜的嫁接成活率均高达90%以上，分别为97.78%、96.08%和93.75%（表3）。 表明“Y 型”劈接法也适用于其他双子叶植物的嫁接。

表2 不同嫁接法棉株成活率和生长速率统计

表3 采用“Y 型”劈接法嫁接植株成活率统计

3 讨论

影响嫁接成活的因素很多，其中砧木与接穗间形成层的再生、砧木和接穗的营养积累与水分的运输、愈合组织的形成是嫁接成活的关键。 再生形成层和愈伤组织形成的多少、快慢是影响嫁接成活率高低的主要原因[14]。 本研究比较了7 种不同的棉花嫁接方法， 以便建立一种适宜棉花嫁接的高效嫁接技术体系。 研究探索出一种新的适合多种双子叶植物（包括棉花）和幼嫩枝条嫁接技术—“Y 型”劈接法。

3.1 “Y型”劈接法操作简单，接穗固定方便且愈合快，成活率高，砧木可使用时期长

与前人报道常规劈接法相比[2-5]，“Y 型”劈接法嫁接棉苗成活率极高的关键在于砧木的切口同时穿过叶柄下段和茎的中轴，利用叶柄下段切口自然夹力的固定作用将接穗和砧木固定并紧密结合在一起，用塑料绳缠绕或夹子稍加固定即可；不需要用手指捏住切口将接穗和砧木固定。 更为重要的是，叶片光合作用的营养物质可通过叶柄就近输送入接穗中，促进接口迅速愈合。 砧木与接穗间接触面较多，营养物质和水分等交换的多、快，因此再生形成层和愈伤组织形成较多、较快。 整个嫁接操作简单，固定方便，嫁接速度快，且成活率高达92%以上。 适合常规劈接法的砧木时期大约仅有1 周[2-5]、插皮接法的砧木需要有一定木质化程度苗龄较大的砧木[6]。 本研究中的“Y 型”劈接法砧木可使用时期较长，从出现1 片真叶至6 片真叶的苗龄期均适用。 不必多次种植砧木，便于管理，可节约成本，节省人力。

3.2 “Y型”劈接法采用逐步定量打孔透气，对环境的温、湿度无需严格控制

早期报道的棉花嫁接方法大多采用提前练苗后进行保湿和透气，保湿用的是剪去瓶口的透光性好的矿泉水瓶（或烧杯、罐头瓶等）将其罩住，然后浇上水，周缘盖土来密封，以保湿防接穗萎蔫。太早透气棉苗会萎蔫，太晚会发霉，造成嫁接成活率较低[2-4]。吴慎杰等[6]在此基础上进行了改进，用带盖的剪去瓶底的透光性好的塑料瓶将其罩住，3～4 d 后拧松瓶盖进行通气，第7 d 去掉瓶盖，12 d 后揭瓶，延长了练苗时间，增加棉苗透气、保湿，并抑制发霉。随后的多种棉花嫁接方法中采用塑料薄膜包裹整个嫁接植株花盆保湿，用遮荫棚进行遮阴，7～10 d后去膜，对环境的温、湿度需要严格控制[9-11]。 本研究发明的“Y 型”劈接法包膜后，膜内的湿度很快上升接近于100%，采用铅笔逐步定量打孔透气，开始打孔后湿度会逐渐降低到70%～75%， 对环境的温、湿度不需要严格控制。通常只有在5―9 月有超过28 ℃的晴天天气时， 在室外环境中需要50%～75%的遮阳网在顶部遮阳，10 月至翌年4 月底在正常管理的温室环境中（20～37 ℃）不需要遮阳。 转基因棉苗和组培苗可以随时嫁接，对温室环境和大田环境要求不严。本发明“Y 型”劈接法突破苗木一般在春季进行嫁接的局限[15-16]，在夏季幼嫩枝条上也可以实现嫁接，保留叶片保湿，上面遮阳，可整年用于组培苗的嫁接。

3.3 “Y型”劈接法应用广泛

本研究发明的“Y 型”劈接法不仅适用于转基因和组织培养再生棉株幼苗和幼嫩枝条的嫁接，还适用于其他多数双子叶植物幼苗和幼嫩枝条（如黄瓜、甜瓜、西瓜和果树、沙棘等林木）的嫁接，应用范围非常广泛。 构建完善的高效的棉花嫁接技术体系，能很好地解决了棉花转基因无菌苗的定植困难问题；同时还能抢救污染苗、畸形苗等无需长根的棉苗[4]，嫁接棉苗生长发育旺盛，能提早开花、结实，且能保持优良性状，缩短育种周期[7-8]。 完善的嫁接体系的建立将有助于加快现代生物技术在植物遗传改良上的广泛应用，例如已有报道嫁接对根- 冠互作机制研究[17]、嫁接对提高棉花耐NaCl 胁迫的效应的研究[18]及利用嫁接系统研究棉花抗黄萎病机理[19-20]。

4 结论

本研究建立了一种双子叶植物幼苗和幼嫩枝条的高效“Y 型”劈接嫁接方法。砧木的切口同时穿过叶柄下段和茎的中轴，利用叶柄下段切口自然夹力的固定作用便于接穗和砧木固定并紧密结合，尤其叶片光合作用的营养物质可通过叶柄就近输送入接穗中，促进接口迅速愈合。整个嫁接操作简单，嫁接速度快，且成活率高达92%以上。 采用定量逐步打孔透气，对环境的温、湿度无需严格控制。此技术体系突破苗木一般在春季进行嫁接，并且可整年用于棉花转基因苗和组培苗的嫁接。