用半致死温度法鉴定北疆不同时期主栽棉花耐寒性

闫臣，陈玉童，刘芯邑，张德恩，李志博

（石河子大学农学院/ 新疆生产建设兵团绿洲生态实验室，新疆石河子832003）

棉花是我国主要的经济作物，起源于热带亚热带地区，对低温比较敏感。 低温胁迫是限制其生长发育、成熟和地域分布的最重要逆境因子之一[1]。低温胁迫可以引起棉花光合气体交换参数、叶绿素荧光、可溶性糖等一系列指标变化[2]；造成棉花细胞中叶绿体膜破损， 类囊体膜的膜质组分和膜蛋白改变，破坏类囊体内膜的超微结构[3]；使植物的光合过程因光抑制而受到影响，导致光合能力下降[4]；使棉花生育期延迟、花蕾脱落，品质和产量严重下降[5]。此外低温使棉株更容易感染真菌、诱发多种病症[6]。新疆是我国最大的棉区，2018 年播种面积占全国的74%以上，是国家主要商品棉基地。 受其地理位置影响，新疆有着“前期升温慢、后期降温快”的气候特点，且春季气候多变，常出现“倒春寒”[2]。 因此对棉花品种耐寒性进行分析鉴定对引种、抵御低温具有一定指导作用。

半致死温度（LT50）常用于植物抗逆性，尤其在耐寒性鉴定。有人认为，用生长恢复试验、组织褐变来估计低温下的致死温度分析耐寒性并不准确[7]，用Logistic 方程求出LT50并进行耐寒性鉴定评价更为可靠，此方法已经在桃树[8]、菊花[9]等多种作物上得到应用。 关于棉花耐寒性分析，前人多对发芽率、叶片光合气体交换参数、叶绿素荧光、抗氧化酶、叶片渗透调节物质等指标进行测定[2，6，10]，而并未见到LT50相关报道。 为此，本文以北疆植棉区的不同时期选育的代表性棉花品种为试验材料，用LT50对这些品种不同生育期的耐寒性进行鉴定评价，以期为棉花耐寒性品种选育及建立耐寒鉴定方法提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

选用28 个棉花品种， 包括24 个北疆棉区不同时期选育的代表性棉花品种和4 个引进品种。其中引入材料中棉所36、中J9645、中JX4 的幼苗具有较强耐寒性，文中用A1－A3 表示，引入材料新陆中26 号为南疆1 个主栽棉花品种，用A28 表示。 新陆早 7 号、8 号、10 号、13 号、19 号、21 号、23 号、24 号、25 号、26 号、33 号、35 号、36 号、41号、42 号、45 号、46 号、48 号、50 号、54 号、60 号、61 号、66 号、74 号为不同时期选育审定的适宜北疆棉区的代表性棉花材料， 在文中依次用A4－A27 表示。

1.2 低温处理

各参试材料随机取完整、 无病虫害的功能叶片，经自来水洗净后，再用去离子水漂洗数次，用滤纸吸干叶片表面的水分，用叶片打孔器避开叶脉打孔，得到30 片小圆片，分装入具塞试管，再分别放入可控式冰箱内，温度分别设为－2℃、－4℃、－6℃、－8℃、－16℃。

1.3 指标测定

1.3.1细胞伤害率的测定。处理12 h 后分批取出，4 ℃解冻 1.5 h，室温平衡 30 min 后，加入 20 mL 去离子水，浸泡10 h 后用DDSJ-308A 型数字电导仪测定浸出液电导率Rc（测时摇匀）。 再将三角瓶用保鲜膜封好放入水浴锅100℃蒸煮30 min，放置至室温，再次测定其电导率Rb，用公式①、②求出相对电导率和伤害率。

式中：R 表示相对电导率，Rc 表示低温处理后电导率，Rb 表示煮后电导率，I 为伤害率，Re 为蒸馏水电导率（因本实验用的去离子水，可将Re 计为零）。 故公式②可转化为③式如下：

1.3.2Logistic 方程的建立。Logistic 方程是 1 个典型的“S”曲线方程，方程为：y＝k/（1＋ae－bt），k、a、b为常数。 方程中y代表细胞伤害率，t代表处理温度，k 为细胞伤害率的饱和容量为100[8]，b 表示温度与细胞伤害率之间的函数关系，a 反映方程曲线与原点之间的相对位置关系[11]。朱根海等[7]、李华伟等[12]、王永红[13]认为应用电导法配合Logistic 方程求出S 形曲线的拐点温度能较准确地估计出植物组织的LT50，可作为反映植物耐寒性的1 个重要指标。

1.3.3LT50 的计算。将 Logistic 方程y＝k/ （1＋ae－bt）进行线性化转化处理，ln[（k－y）/y]＝lna－bt，令y1＝ln[（k－y）/y]，则转化为转化细胞伤害率y1与处理温度t的直线方程[11-12]。 求出拐点d2y/d2t时的t值，即 lna/b 为LT50值[7-8，11-12]。采用胡文冉[14]的方法计算LT50，并稍加改变，通过公式y1＝ln[（k－y）/y]， 利用y值与 k 值分别求出y1， 再利用 Excel 2016 图表工具拟合转化细胞伤害率y1 与处理温度t的直线方程，分别求出lna 和b 值，进而计算出LT50。

1.4 数据与分析

利用SigmaPlot 12.5 进行作图及方差分析，利用Excel 2016 进行数据分析及其Logistic 回归模型的建立，利用SPSS 19.0 对LT50进行K 类均值法聚类分析。

2 结果与分析

2.1 棉花品种细胞伤害率与胁迫温度Logistic回归模型的建立

本实验对各参试材料不同生育期的Logistic曲线进行线性化处理，拟合出了转化细胞伤害率与温度之间的线性关系，最终得出Logistic 方程（表1）。结果表明，拟合度大于0.8 的方程占91.07%，相关性较高，故用此法计算LT50，数据较可靠。

不同生育期，28 个棉花品种的Logistic 曲线见图 1。 由图 1 可知，4 个生育期下，28 个棉花品种叶片的细胞伤害率均随着处理温度的降低明显波动式增大， 细胞伤害率与处理温度呈现明显的负相关关系。

盛蕾期Logistic 曲线呈典型的“S”型，大多数品种25～－2 ℃范围内， 细胞伤害率缓慢增加，表明在这温度范围内， 棉花细胞质膜损伤能自动修复，处于动态平衡状态；大多数品种在－2～－6 ℃范围内，细胞伤害率迅速增加，表明此温度范围内细胞质膜损伤大于修复，损伤程度愈加严重。因此，可以认定－2 ℃为盛蕾期棉花耐寒性的临界温度。细胞质膜损伤程度逐渐加重，大多数品种细胞伤害率在－6 ℃后趋于平稳， 少数品种在－8 ℃后趋于平稳。

各品种苗期、吐絮期的Logistic 曲线最后未趋于平稳，只呈现“S”型的前一部分，这2 个时期大多数品种细胞伤害率在－4℃后开始快速上升， 基本未趋于平稳。大多数棉花品种在花铃期对低温比较敏感， 细胞伤害率－2～25 ℃随温度降低迅速增加， 低于－2 ℃后多数品种细胞伤害率缓慢增长，呈现“S”型曲线的后一段，可知棉花在此时期耐寒性较弱，容易受到冷害。 同时结合LT50（表 1），可认定苗期、花铃期、吐絮期棉花耐寒性指标的临界温度分别为－4 ℃、2 ℃、－4 ℃， 对棉花耐寒性鉴定工作有一定的帮助。

2.2 不同生育期LT50的确定

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图1 不同时期棉花各品种叶片细胞伤害率与处理温度之间的Logistic 曲线

计算Logistic 曲线拐点温度作为植物组织的LT50，通过比较各品种LT50，可以鉴定其耐寒性。 分析结果（图2）看出，同一棉花品种在不同生育期的LT50并不相同，表明不同生育期棉花的耐寒机制或关键耐寒指标因子不同。 从苗期、盛蕾期、花铃期、吐絮期所有参试材料的LT50范围分别在－9.07～－0.12 ℃、－4.43～4.25 ℃、－4.02～9.69 ℃、－15.76～3.06 ℃来看，苗期、吐絮期的LT50几乎均在0 ℃以下，说明参试材料在苗期和吐絮期均具有较好的耐寒性。根据确定的LT50，所有参试材料中，苗期、盛蕾期、花铃期、吐絮期耐寒性最强的材料依次分别为新陆早36 号、 新陆早7 号、 新陆早 50号、新陆早35 号，而耐寒性最差的材料依次分别为新陆早60 号、新陆早25 号、新陆早13 号、新陆早54 号。

图2 棉花品种在不同生育期的LT50

图3 不同生育期各品种LT50 平均值差异分析

取所有参试材料的LT50平均值， 进一步对不同生育期棉花的LT50变化趋势进行了分析 （图3）。研究发现，随着生育进程推进，不同生育期棉花的LT50有先升高后下降的趋势，其几乎均达到显著差异。 其中花铃期的棉花材料的LT50平均值为2.23 ℃，为4 个生育中最高，而苗期的参试材料的LT50平均值是4 个生育期中最低的， 为－4.79 ℃，进一步表明，花铃期棉花适宜生长需要较高的生长温度， 也说明不同生育期棉花的耐寒机制不一样，不同生育期棉花的LT50耐寒分类标准不一样，对棉花全生育期的耐寒性鉴定需要考虑棉花不同生育期。

2.3 不同生育期棉花耐寒性鉴定及耐寒等级标准建立

将棉花耐寒性分为高抗、抗、中抗、弱抗和寒敏感5 个级别进行鉴定评价。 K 类均值法聚类分析（表2）结果表明，28 个参试品种在不同生育期的耐寒鉴定级别所占比例和结果不同。 仅有1～2 个品种在4 个生育期中表现为寒敏感，表明北疆植棉区棉花品种都具有一定的耐寒性。 4 个生育期鉴定结果为高抗的棉花品种有明显的差别， 其中苗期、吐絮期的比例较低，分别为7.14%、3.57%；而盛蕾期和花铃期的高抗比例明显升高， 分别达到了32.14%、17.86%，这说明盛蕾期和花铃期比苗期和吐絮期相对要求较高的温度，也表明不同生育时期棉花的耐寒机制和耐寒性不同。 综合来看，A15（新陆早35 号）和 A2（中 J9645）在 4 个生育期的分级结果均为高抗或抗， 表明它们具有较好的耐寒性，可以作为棉花耐寒种质资源加以使用；而A13（新陆早26 号）的综合鉴定结果均为弱抗，表明其全生育期的耐寒性较差。

表2 不同生育期耐寒性分级的聚类分析

依据表2 的分析结果，根据入选的不同耐寒类别棉花的LT50，本实验又初步建立了不同生育期棉花耐寒性级别划分的LT50标准（表3），期望为应用LT50鉴定不同生育期棉花种质资源的耐寒性提供科学指导。

表3 不同生育期棉花不同类别耐寒性LT50 的确立 ℃

3 讨论与结论

膜系统是植物受低温伤害和抵抗低温伤害的关键结构[13]。 低温胁迫下，棉花叶片质膜透性与其耐寒性呈负相关， 可以作为耐寒性的鉴定指标[15]，质膜透性增加，电解质会出现不同程度的外渗[8，10，13]，电解质外渗率与原生质膜受害程度成正相关[16]，电解质外渗率与细胞伤害率已经成为低温伤害的标志[8，12-13]。

本试验中，随着温度的降低，大多数品种细胞伤害率呈现“慢- 快- 慢”的增长趋势，这与前人试验结果基本一致[8-9，12]。 本试验结合朱根海等[7-8，14]方法，建立了28 个品种的Logistic 方程，结果显示大部分品种细胞伤害率与温度之间呈现典型的“S”型，方程拟合度较高，初步表明Logistic 方程结合LT50可用于棉花耐寒性鉴定。

分析发现，不同生育期下各个棉花品种的LT50并不一致，表明棉花材料之间耐寒性存在差异。 花铃期的LT50平均为2.23℃， 明显远高于其他3 个生育期，主要原因可能是花铃期是棉花生殖生长与营养生长两旺期，也是水肥敏感时期，水肥均可对棉花产生胁迫，不仅仅体现在低温胁迫上，同时与花铃期棉花适宜生长需要相对较高的温度相符。耐寒性鉴定结果表明， 中J9645 和新陆早35 号耐寒性最强，新陆早36 号次之，新陆早26 号对低温最敏感。 其中，中J9645 是中棉所鉴定出的耐寒性强的棉花材料， 本试验结果与其一致， 进一步表明Logistic 方程结合LT50可用于棉花耐寒性鉴定评价。 整体上，棉花对低温比较敏感，耐寒性相对较差，28 个品种各时期LT50较一些木本植物或一些耐冷植物偏低。

不同时期的28 个品种LT50平均值存在显著差异， 即不同生育期棉花耐寒性之间存在显著差异，再次表明不同生育期棉花耐寒机制不同，故而不能仅通过1 个生育时期的鉴定结果对棉花耐寒性评价，需建立不同生育期相应的适宜评价指标体系。实验划分出每个生育期棉花耐寒性级别，确立不同生育期棉花耐寒性标准，认为苗期、盛蕾期、花铃期、 吐絮期棉花耐寒性指标的临界温度分别为－4 ℃、－2℃、2 ℃、－4 ℃，为棉花材料耐寒性、品种选育和栽培管理提供一定的科学依据。但此实验是基于新疆地区主栽早熟棉花品种，且第1 次用Logistic 方程结合LT50运用到棉花耐寒性鉴定，研究结果还有待深化。