一例高致病性猪蓝耳病、猪流行性腹泻混合感染的诊断

何德肆，李海辉，颜 爱，彭兰丽，曾 焕

（1.湖南生物机电职业技术学院，湖南 长沙 410128；2.湖南猪卫士科技服务有限公司，湖南 长沙 410128）

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhoea，PED）是 由 猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的一种急性、高度传染性肠道病毒性疾病。PEDV通过感染肠道上皮细胞，引起仔猪腹泻、脱水及高死亡率。2010年PEDV在我国的再次流行给养猪业造成了巨大的经济损失[1]。

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），俗称“猪蓝耳病”，是由猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的以母猪繁殖障碍及各阶段猪呼吸障碍为特征的传染病。这个高度可变的RNA病毒是在近30年前被发现的，尽管进行了广泛的研究，其仍然在世界范围内广泛流行，是养猪业面临的一大难题[2-3]。

相关研究数据表明[4-5]，猪感染PRRSV有利于PEDV在猪场的流行，而猪感染PEDV后，继发PRRS则会加剧猪只死亡率。近年来虽少有混合感染PRRSV、PEDV的相关案例报道，但需加强重视。

1 材料和方法

1.1 发病情况

2018年11月，湖南郴州某规模猪场（存栏母猪300头）新生2～4 d仔猪出现水样腹泻，发病率70%，死亡率50%。推测由PEDV引起，采用免疫、补液等措施，疫情有所控制；3周后新生仔猪再次出现腹泻，母猪伴随高热、厌食症状，同样防控方案无效，仔猪死亡率高达90%。为确诊，剖检2头发病猪，取其相应组织送往实验室进行猪蓝耳病、猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎及轮状病毒的诊断。

1.2 试验材料

1.2.1 病料采集

猪肺脏、扁桃体、淋巴结、小肠组织。

1.2.2 试验试剂

即用型PCR试剂盒购自北京天恩泽基因科技有限公司；AxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit购自美国康宁生命科学有限公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；DNA Marker购自宝生物工程（大连）有限公司；引物合成及测序由华大基因公司完成。

1.3 试验方法

1.3.1 病毒基因PCR扩增检测

剪取适量组织充分研磨后，按照AxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit试剂盒说明书的操作步骤提取病毒基因组，按RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒说明书将提取的病毒基因组进行反转录，得到cDNA。设计引物检测PEDV、TGEV、RV、PRRSV，引物序列见表1，PCR产物于2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，用紫外凝胶成像仪分析。

1.3.2 基因测序分析

根据1.3.1检测结果，设计检测PRRSV Nsp2、PEDV ORF3基因引物用于病毒测序，引物序列见表1，测序由华大基因完成。

2 试验结果

2.1 病毒PCR结果

用鉴别诊断猪经典与变异蓝耳病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、轮状病毒的特异性引物进行PCR扩增，由图1-图4可知，从病料中扩增出了与变异猪蓝耳病病毒和猪流行性腹泻病毒相符合的目的条带，未检测到传染性胃肠炎病毒及轮状病毒。

2.2 测序分析结果

为确定分离株是否为变异毒株，设计相应引物进行测序分析，结果见图5、图6。在PRRSV粒子中，最为保守的蛋白为M蛋白，其次是N蛋白，变异最为显著的是Nsp2、GP3、GP5，因此，在进行PRRSV进化分析时，常用M、N及Nsp2进行分析。此案例中选用Nsp2进行测序比对分析，由图5可知，分离株（称为PRRSV isolate）与JXA1等其他高致病性毒株同源性较高，与经典毒株BJ4、VR2332及类NADC30毒株相距较远，为高致病性毒株。

表1 引物列表

PEDV ORF3编码非结构蛋白，其可用来进行PEDV分子流行病学研究，从图6可知，案例分离毒株（PEDV isolate）与经典毒株CV777相距甚远，隶属于2010年出现的变异毒株，根据分类[6]，其隶属于GⅡb群。

3 分析

猪流行性腹泻是由PEDV引起的一种严重危害猪生产的病毒性传染病，自2010年以来，PED在我国不同地区陆续暴发造成了重大经济损失，据统计部分猪场产房新生仔猪死亡率高达100%。遗传进化分析显示，2010年后新出现毒株与之前毒株（代表株CV777）有显著差异。对来自不同国家上传的409株全基因序列进行分析，进化树结果显示PEDV可分为2个群：GI（经典）和GII（变异），2010年后在全球高度流行的PEDV毒株大部分隶属于GII基因群，而GII群又可分为3个亚群（GII-a、GII-b、GII-c）[7]。在此案例中所分离到的毒株经测序分析与GII-b高度同源，为变异毒株。

PRRS是由PRRSV引起的一种以母猪发热、厌食和流产、产弱仔等繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征的传染病。2006年，新出现的高致病性PRRSV导致大量猪只死亡，2012年，NADC30-like毒株的出现和流行，以及不同毒株间的重组变异，使得猪蓝耳病一直是我国乃至全球养猪业面临的一大难题[8]。此案例分离毒株与JXA1毒株高度同源，为高致性毒株。

根据近几年文献调查，猪蓝耳病和猪流行性腹泻的混合感染相对较低，但其混合感染所造成的影响不容小觑。研究人员对生长育肥猪人工接种PRRSV和PEDV，结果显示PRRSV+PEDV混合感染组平均日增重、平均日采食量、料重比、及主要养分及能量的表观全消化道消化率低于单独感染组及对照组，尽管单独感染PRRSV不会改变猪肠道形态及完整性，但在感染PEDV后再混合感染PRRSV，PRRSV将加重肠道损伤程度[9-10]。PRRSV和PEDV均是近年来影响全球养猪业的重要病原，对于其混合感染的研究也较少，但对于猪场管理人员，需密切关注场内PRRSV、PEDV的感染动态，在发生新生仔猪腹泻疫情时，需警惕猪蓝耳病的混合或继发感染，从而避免重大的经济损失。