抑制COX-2表达对心肌缺血再灌注损伤过程中心肌细胞保护作用的研究

贾 丹，张 媛，连 鑫，庞 磊，麻海春，姜 曦

(吉林大学第一医院 1.泌尿外二科；2.麻醉科；3.健康管理中心，吉林 长春130021)

研究表明在缺氧缺血的心肌细胞中，环氧化酶(COX-2)呈高水平表达，且其表达水平直接影响心肌细胞发生凋亡的严重程度[1-3]。虽然介导心肌细胞缺血再灌注损伤(MI/RI)的分子机制尚未完全明了，但MI/RI过程可能涉及众多潜在的病理生理学机制，例如细胞凋亡的激活、活性氧(ROS)的形成，以及炎症反应等。本研究通过对大鼠心肌细胞(H9C2)进行缺氧/复氧(H/R)实验，研究MI/RI过程中，COX-2表达水平与细胞损伤之间潜在的因果联系与分子基础。

1 材料与方法

1.1 实验分组

将大鼠心肌细胞H9C2(ATCC公司，美国)随机分为三组：对照组(CTL)、缺氧/复氧组(H/R)和给药组[H/R+10 μM Helenalin(H/R+H)，或H/R+10 μM NS398(H/R+N)][4]，细胞培养及处理方法详见文献[5]。

1.2 细胞活力检测

采用乳酸脱氢酶(LDH)活性检测试剂盒(Roche公司，德国)检测不同组别细胞培养基中LDH的活性，判定各组细胞损伤的程度[6]。

1.3 免疫印迹试验

采用免疫印迹方法对各实验组细胞中的蛋白表达水平进行检测，检测所需抗体及其稀释倍数分别为：COX-2(1∶1000)、β-action(1∶1000)、IκBα(1∶1000)、p-IκBα(1∶1000)、p65(1∶1000)、p-p65(1∶1000)。实验所需抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。采用Image J软件对蛋白表达水平进行定量分析。

1.4 COX-2活性分析

采用COX活性检测试剂盒(Cayman，美国)，通过荧光法对各实验组细胞中的COX-2活性进行检测。

1.5 ROS含量测定

分别将各组细胞接种在96孔板上，对其进行不同组别的预处理，然后用二氢乙锭孵育细胞，收集细胞并检测荧光，评估细胞内ROS含量。

1.6 实时定量PCR(qPCR)分析

提取并收集各组细胞中的mRNA，取等量不同组别的mRNA进行qPCR，反应条件如下：95℃变性30 s，95℃扩增6 s，重复40个循环，60℃30 s。选取同一样本中的β-actin作为内参，对各组数据进行比较分析。引物序列详见文献[7]。

1.7 数据统计学分析

本研究采用SPSS21.0软件包进行统计学处理，使用GraphPad Prism 5.0软件做图，采用单因素方差分析进行多组间比较，组间两两比较采用t检验。P<0.05时，差异被认为具有统计学意义。

2 结果

2.1 NFκB的激活介导H/R过程中COX-2表达上调

H/R能够诱导心肌细胞发生损伤，实验组细胞在受到H/R刺激后，COX-2表达水平上升，LDH释放量明显高于对照组细胞；而加入NFκB抑制剂Helenalin处理后，COX-2水平下降，心肌细胞的LDH释放量下降(图1)。

图1 H/R诱导后，各组细胞LDH释放水平差异

在H9C2细胞受到H/R刺激后，伴随COX-2升高的同时，IκBα降解增强，IκBα水平下降，IκBα和p65的磷酸化增强；Helenalin能够有效抑制上述变化(图2)。

2.2 抑制COX-2活性能够降低H/R诱导的促炎症因子转录

与对照组相比，H/R刺激选择性地诱导白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNFα)的mRNA表达，而不影响白介素-1β(IL-1β)；给予COX-2选择性抑制剂NS398可显著抑制IL-6和TNFα的高表达(图3)。

2.3 抑制COX-2活性能够降低H/R诱导的H9C2心肌细胞内ROS活性

在细胞受到H/R刺激后，与对照组相比，H/R组中ROS活性明显升高；然而，这种H/R诱导的ROS活性增加能够被COX2选择性抑制剂NS398显著抑制(图4)。

3 讨论

一直以来，COX-2被认为与炎症反应息息相关，包括血管舒张、组织水肿和疼痛[8]，有研究显示，COX-2的效应蛋白前列腺素在MI/RI炎症反应中发挥重要作用[9]。前期研究显示，抑制COX-2将通过Akt/iNOS/NO信号通路保护心肌细胞免受凋亡的影响[6]。

研究中发现，细胞在受到H/R刺激时，伴随COX-2升高的同时，IκBα降解增加，IκBα和p65的磷酸化增强，以上结果均提示NFκB蛋白被激活[10]。为了检测在H/R过程中心肌细胞中COX-2的诱导是否由NFκB介导，我们采用NFκB选择性抑制剂Helenalin对细胞进行预处理。抑制剂预处理显著抑制了H/R所导致的COX-2诱导，提示H/R过程中COX-2表达上调由激活的NFκB介导。

图2 受到H/R刺激后，各组细胞中不同蛋白的表达水平变化及量化分析

图3 H/R后，各组细胞中IL-1β、IL-6和TNFα的mRNA表达水平及量化分析

图4 H/R后，各组细胞中ROS活性量化分析

缺氧能够诱发心肌细胞发生无菌性炎症，大量炎症因子释放，细胞趋化、浸润对心肌细胞造成损伤，导致心肌细胞凋亡以及随后的心功能障碍[11]。本研究发现，H/R刺激选择性地诱导心肌细胞IL-6和TNFα的mRNA表达，二者是已知与促凋亡作用相关的炎症因子[12,13]。TNFα是经典NFκB信号通路的重要激活因子[14]，当其转录活性增强时，能够激活NFκB表达，并进一步介导COX-2表达，造成心肌细胞损伤。COX-2选择性抑制剂NS398能够显著抑制H/R介导的IL-6和TNFα转录水平变化，提示抑制COX-2活性能够降低H/R诱导的促炎症因子转录，从而发挥对心肌细胞的保护作用。然而，对COX-2活性进行选择性抑制后，IL-6和TNFα的mRNA水平下调的分子机制尚不清楚，值得进一步研究和探讨。

MI/RI的发病机制十分复杂，涉及众多病理生理因素的相互关联，ROS聚集被认为是导致MI/RI的重要原因之一[15]。在生理状态下，体内的ROS通过多种细胞外和细胞内的代谢活动产生，ROS水平处于动态平衡状态[16]。而在心肌缺血状态下，COX-2被活化，在其催化前列腺素合成的过程中有大量ROS产生[17]，并促进了心肌损伤进一步加剧[15]。此外，过量的ROS产生还能够打破NOS与NO之间的动态平衡，并影响NO的生物利用度[18]。有研究显示，在MI/RI过程中，减少心肌细胞中ROS的形成，能够在心脏组织中产生更高的NO含量，并缩小梗死面积[19,20]。本研究中我们发现，在细胞受到H/R刺激后，ROS活性明显上升，而这一现象能够被COX-2选择性抑制剂NS398显著抑制。这些证据表明，抑制COX-2活性能够降低H/R诱导的H9C2心肌细胞内ROS活性，减轻细胞损伤。

目前，COX-2选择性抑制剂广泛应用于缺血性心脏病的治疗，进一步了解COX-2如何影响心肌细胞凋亡可能具有深远的临床意义。本研究的结果证实，在心肌细胞受到缺氧刺激时，NFκB的激活诱导COX-2表达上调，抑制COX-2活性能够降低H/R诱导的促炎症因子转录以及ROS活性增强，从而发挥对心肌细胞的保护作用。