肾透明细胞癌组织中Cripto-1的表达及其对预后的预测价值

罗文山，赵凌昆，刘婷婷， 张秀利*

(1.吉林大学中日联谊医院，吉林 长春130033；2.佳木斯大学临床医学院，黑龙江 佳木斯154007；3.吉林省军队离退休干部疗养中心，吉林 长春130033)

肾透明细胞癌(ccRCC)是肾细胞癌中最常见的一种病理类型，约占所有肾细胞癌的80%-90%[1]。目前临床上常用TNM分期和Fuhrman核分级对ccRCC的预后进行预测[2]，但相似的TNM分期或Fuhrman核分级的病人也可能有着不同的预后[3]，这显然不符合精准医学的要求。目前也尚无一种理想的预测ccRCC的标志物。Cripto-1也称作畸胎瘤衍生生长因子-1(TDGF-1)[4]，是糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定信号家族的一员[5,6]。目前研究结果表明，Cripto-1在胃癌[7]、乳腺癌[8]、食管鳞癌[9]等恶性肿瘤中高表达，且其表达量与肿瘤恶性程度成正比，与患者生存成反比。Klauzinska等人[10]的研究结果提示Cripto-1可能参与了上皮-间质转化(EMT)。本研究旨在观察Cripto-1在ccRCC中的表达情况，并统计分析其对预后的价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料收集佳木斯大学附属第二医院病理科2014年1月至2016年12月期间，肾透明细胞癌根治术标本和对应的癌旁正常组织标本共76对。年龄38—82岁，平均年龄(59.3±9.5)岁。纳入标准：(1)非囊性的散发病灶；(2)术后病理证实为ccRCC；(3)临床资料完整，完成定期随访。排除标准：(1)双侧病灶；(2)合并其它恶性肿瘤；(3)曾接受过化疗、靶向治疗、免疫治疗、中医治疗等抗肿瘤治疗；(4)围术期发生死亡。病理分期采用TNM分期(2010年AJCC发布)，并根据Fuhrman核分级进行分级。本次研究通过佳木斯大学伦理委员会批准。

1.2 细胞系及试剂人ccRCC细胞系786-O与Caki-1，人肾上皮细胞系293T均购自国家实验细胞资源共享平台。其中786-O和Caki-1用10%胎牛血清(FBS)、0.2%双抗青霉素和链霉素的RPMI-1640培养基，293T用10%胎牛血清、0.2%双抗青霉素和链霉素的DMEM培养基。细胞培养条件为恒温37℃，恒定湿度，5%浓度的CO2。培养基均购自Gibico公司；Trizol购自Thermol公司；反转录试剂盒、RT-qPCR试剂盒购自谷歌生物技术有限公司；兔抗人Cripto-1单克隆抗体、β-actin单克隆抗体、羊抗兔辣根过氧化物酶标记的二抗，免疫组化试剂盒均购自CST公司。

1.3 实验方法免疫组化染色严格按照试剂盒说明书进行，根据染色强度和结合程度综合评分判定结果：无染色(0分)，淡黄色(1分)，棕黄色(2分)，黄褐色(3分)；阳性细胞<5%(0分)，5%-25%(1分)，26%-50%(2分)，>50%(3分)。将染色程度和阳性染色细胞数量得分相乘，≥6分为阳性表达，<6分为阴性表达。应用RT-qPCR检测mRNA表达情况。应用Western-blot检测蛋白表达情况。应用shRNA对Cripto-1基因表达进行敲降。应用CCK-8检测细胞增殖能力。应用Transwell实验检测细胞迁移能力。

1.4 复查与随访方法术后24个月内，每3个月复查1次；第3年起，每6个月复查一次。复查内容包括血清肿瘤标志物检查、胸腹盆腔CT等。所有患者均实行门诊或电话随访，结合相关护理情况。终止时间定义为经病理学诊断为复发、因肿瘤死亡，或随访满60个月。

1.5 统计学方法所有数据应用SPSS(Ver 19.0 IBM，NY)进行统计分析。本次研究所有数据结果均经过三次生物学重复，数据以(均数±标准差)的形式表示。分类变量应用卡方检验，计量资料用Studentt检验，生存曲线应用Kaplan-Meier方法绘制，并应用对数秩检验评估差异。应用Cox比例风险模型进行单因素和多因素分析。

2 结果

2.1 Cripto-1在肿瘤组织和正常肾组织中的表达情况对肿瘤组织和正常肾组织Cripto-1进行免疫组化染色，可以发现，Cripto-1主要定位在细胞质中。Cripto-1在肿瘤组织中，无论是蛋白水平，还是mRNA水平的表达显著高于正常组织(P<0.05)。见图1。

a.在正常肾组织中阴性表达；b.在肿瘤组织中弱表达；c.在肿瘤组织中强表达；d.两种组织中Cripto-1 mRNA相对表达量；e.Cripto-1蛋白在两种组织中的表达情况

2.2 Cripto-1的表达与临床病理参数的关系根据Cripto-1的表达对患者进行分组，76例病人中，Cripto-1高表达49例，低表达27例。Cripto-1的表达与T分期、N分期、TNM分期相关(P<0.05)，而与性别、年龄和Fuhrman核分级无相关性(P>0.05)。见表1。

2.3 Cripto-1的表达与患者预后的关系Cripto-1高表达组的患者5年无病生存率(DFS)和总体生存率(OS)均显著低于低表达组(P<0.05)。见图2。

2.4 Cripto-1的表达对细胞增殖、迁移和侵袭的影响为了观察Cripto-1对细胞增殖、迁移和侵袭的影响，利用shRNA对786-O与Caki-1两株细胞系的Cripto-1进行敲降，构建Cripto-1低表达的稳转细胞株。并检测细胞增殖、迁移和侵袭的变化。结果发现，在敲降Cripto-1之后，细胞的增殖活性、迁移能力和侵袭能力均发生不同程度的降低。见图3。

表1 Cripto-1表达与临床病理参数的关系

a.两组总生存率比较；b.两组无病生存率比较

3 讨论

Cripto-1属于表皮生长因子-富半胱氨酸(EGF-CFC)家族，目前发表的研究结果大部分认为，其作为发挥调解细胞分化和胚胎发育功能的蛋白，主要在胚胎早期表达，同时，当体内细胞发生上皮间质转化，或形成肿瘤时，Cripto-1也出现高表达，并且在多项研究中已经证实，其可能会促进肿瘤细胞的增殖，提高肿瘤细胞迁移和侵袭的能力[11-13]。另外，也有研究者认为其可能与肿瘤预后有关[14,15]。Cripto-1是否在肾透明细胞癌中也发挥着同样的作用，目前相关研究较少。

本研究对76对ccRCC肿瘤组织和正常组织进行了免疫组化染色，并提取组织中RNA和蛋白，行RT-qPCR和Western blot检测，发现在ccRCC组织中，无论是mRNA还是蛋白水平，Cripto-1的表达均显著升高。这提示Cripto-1在ccRCC的恶性进展中，可能也起到了一定的作用[16,17]。而Cripto-1并不是完全在正常组织中不表达，在IHC结果中也发现有部分正常肾组织也表现为Cripto-1弱阳性表达，回顾这些病例，发现大多为分期较晚的患者，这种现象可以用“区域性癌化”来揭示，即肿瘤的发生是一个累积的过程，遗传物质在逐步发生改变，正常组织在转变为恶性癌组织之前，已经开始呈现了一种“癌前”的状态，这种形态下的细胞，形态学上是正常的，但是遗传物质可能已经发生了改变。这也提示Cripto-1是否可以作为一个标志物，去鉴别形态学正常的细胞，是否即将发生恶性改变，这个问题值得进一步研究。

(A-D)786-O与Caki-1细胞系在敲降Cripto-1后增殖能力的变化；(E-F)Transwell实验验证786-O与Caki-1细胞系在敲降Cripto-1后迁移能力的变化；(G-H)划痕实验验证786-O与Caki-1细胞系在敲降Cripto-1后侵袭能力的变化

根据IHC的结果，将患者分为Cripto-1高表达组和低表达组，并对临床病理资料进行了统计分析，结果发现Cripto-1高表达组的患者，肿瘤恶性程度更高，Cripto-1高表达组有23例(46.94%)患者为T3-T4期，28例患者(57.14%)存在淋巴结转移，22例患者(44.90%)的TNM分期为Ⅲ-Ⅳ期，这些都显著高于Cripto-1低表达组(P<0.05)。而进一步对患者进行随访时发现，Cripto-1高表达组的患者，无论是5年无病生存率还是总生存率，均较Cripto-1低表达组的患者要差(P<0.05)。本研究又用体外实验进行了原因的探索，选择了本身Cripto-1表达较高的786-O和Caki-1细胞系，并应用shRNA对Cripto-1进行了敲降(Knockdown)，并进行了一系列的功能学实验。结果发现，在敲降了Cripto-1之后，两种细胞系的增殖、迁移和侵袭能力都受到了显著的影响，具体表现为增殖速度下降、迁移和侵袭的能力下降。这提示Cripto-1的高表达，会提高肿瘤细胞的恶性潜能，使其增殖速度更快、迁移和侵袭能力更强，相应的，肿瘤发展更快，且更容易发生术后的复发和转移，这也就解释了Cripto-1高表达的患者预后更差的原因。这也同时提示Cripto-1可能作为一个靶点，对ccRCC进行靶向的治疗。

本研究的局限之处在于，这是一项单中心的回顾性研究，且样本量较小，可以增加中心，扩大样本量进一步对本研究的结果进行验证。另外，本研究仅进行了体外实验的研究，并未进行体内实验，而肿瘤所处的微环境对于肿瘤的发展也至关重要。目前有研究认为Cripto-1可以激活Wnt/β-Catenin信号通路[18]，从而使肿瘤细胞发生上皮间质转化，但本研究并未对该通路的标志蛋白进行检测，未来会进行相关机制方面的探索。

综上，Cripto-1在肾透明细胞癌中表达升高，可以作为判断预后的一项指标，同时也可能成为治疗ccRCC的新靶点。