枸杞饮料乳酸发酵工艺优化及其风味物质分析

王丽萍，颉向红，米江，马露，李佩佩，张喜康，刘敦华

(1.宁夏大学农学院，宁夏 银川 750021; 2.宁夏计量质量检验检测研究院，宁夏 银川 750200)

红枸杞和黑枸杞是市面上最常见的枸杞品种。红枸杞(Lyciumbarbarum,L)，又称枸杞子，是茄科小灌木枸杞的成熟果实，含有多种氨基酸，以及甜菜碱、玉米黄素和酸浆果红素等特殊营养成分，具有较好的保健功效。黑枸杞(LyciumruthenicumMurr)，味甘，性平，富含蛋白质、枸杞多糖、氨基酸和微量元素等多种营养成分，以及丰富的天然水溶性自由基清除剂原花青素，被誉为野生的“蓝色妖姬”[1]。中国在枸杞深加工产业方面主要集中在功能性成分提取利用及保健食品的开发上，包括枸杞油、枸杞多糖以及枸杞酒、枸杞汁及其他枸杞饮料等[2-4]。其中，枸杞饮料最具有开发前景，不仅可以充分利用枸杞资源，还能提高枸杞的功能性，带动地区经济发展。乳酸菌(lacticacidbacteria,LAB)是利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌通称。乳酸菌发酵会产生乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸等多种有机酸以及抗氧化物质[5]，对食品的风味、质构和感官品质具有非常重要的影响，是公认的安全菌[6]。目前，多种乳酸菌的复合发酵一直是研究的热点，尤其在果蔬发酵产品的应用上[7-8]。相比单菌发酵，多菌种发酵能赋予饮料更丰富的营养功能物质以及独特的风味，且多菌种在发酵过程中能协同代谢，可以在短时间内产生更多产物[9]。均匀设计法被广泛应用于食品、化工、建筑等方面，仅需选取少数具有代表性的测试点，就能反映体系的主要特征[10-13]。当多因素多水平的试验和系统模型不确定时，均匀设计法的优势更加明显，其结果还可以通过多种分析软件及回归方法进行分析，确定各因素与指标间的定性关系，从而进一步优化条件。传统食品发酵研究多采用正交试验或响应面试验优化工艺，在多水平多因素条件下试验工作量大且效率低。本试验在单因素试验基础上，采用均匀设计法优化枸杞饮料发酵工艺，以红枸杞和黑枸杞为原料，以嗜热乳杆菌、植物乳杆菌和鼠李乳杆菌进行混合发酵，研制新型复合枸杞汁饮料。最后通过固相微萃取(headspace solid-phase microextraction,HS-SPME)与气相色谱-质谱联用技术(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)分析枸杞发酵饮料中的风味物质，为充分利用枸杞资源，探讨枸杞发酵饮料的生产与加工工艺提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

嗜热乳杆菌(Lactobacillusthermophilus,CICC 20267)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum,CICC 20261)和鼠李乳糖杆菌(Lactobacillusrhamnosus,CICC 20990)均为冻干粉，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

红枸杞和黑枸杞(干果)购自银川新百超市；果胶酶、纤维素酶(食品级，酶活力10 U·g-1)购自河南万邦实业有限公司；没食子酸购自成都普思生物科技股份有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种生长曲线的测定 根据邓放明等[15]的OD值法测菌种生长曲线。参照张盟[16]的方法制备菌悬液。根据《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》(GB4789.2—2016)[17]进行活菌计数。

1.2.2 工艺流程 原料预处理→榨汁→酶解→过滤→巴氏杀菌→乳酸菌发酵→糖酸调配→离心→二次杀菌→灌装→成品

根据颉向红等[14]的方法并改良，将原料按照m(黑枸杞)∶m(红枸杞)=3∶7混合，然后按照m(原料)：V(水)=1∶8加水65 ℃浸泡30 min后打浆，得到枸杞混合浆液；添加质量分数1.6%的复合酶(m(果胶酶)∶m(纤维素酶)=2∶1)，50 ℃酶解60 min，得到枸杞酶解液，经巴氏杀菌，25 ℃冷却得到枸杞汁；将嗜热乳杆菌、植物乳杆菌和鼠李乳糖杆菌发酵剂按体积比例混合后(表1)接入枸杞汁中，以不加乳酸菌的枸杞汁为对照，控制发酵温度30 ℃，发酵时间42 h，得到枸杞发酵液，再经调配，2次杀菌后得到饮料成品。

表1 枸杞饮料乳酸发酵菌种比例设置Table 1 Mixing vatio of strains for lactic acid fermentation of Goji berry beverage

1.2.3 分析方法 总酸测定：NaOH滴定法。总糖测定：斐林试剂滴定法，《中华人民共和国行业标准 果汁通用实验方法》(SB/T 10203—1994SB/T 10203—1994)[18]。总酚测定：福林-酚比色法测定[19]，没食子酸标准曲线方程为y=0.096 5x+0.022 9，R2=0.999 1。类胡萝卜素测定：根据CARBONELL-CAPELLA等[20]的方法测定。

1.2.4 感官评定 采用9点快感标度法[21]。选取10名具有食品专业知识的老师和同学组成感官评定小组，评定内容包括产品的酸甜度、口感、色泽、香气和整体接受性。各属性分别有9个不同的评级来表示评估者的偏好水平，评分标准如表2。

表2 感官评定表Table 2 Items of sensory evaluation for the beverage

1.2.5 枸杞饮料发酵单因素试验 分别设定乳酸菌接种体积分数为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%和4.0%，发酵时间为12、18、24、30、36、42、48和54 h，发酵温度为20、25、27、30、32、35、37和40 ℃，考察不同因素对发酵结果的影响。以发酵后溶液中总酸、总糖、总酚和类胡萝卜素质量浓度为指标评价。

1.2.6 枸杞饮料发酵均匀设计试验 在单因素试验的基础上，采用均匀设计法设计3因素8水平试验，即U8(83)。各组试验产品的综合得分参照李玉龙等[22]的方法求得。均匀设计试验的因素与水平见表3。

1.2.7 挥发性物质的测定[23]利用HS-SPME-GC-MS(GCMS-QP2010气相色谱-质谱联用仪，日本岛津公司)对发酵前后的样液进行测定。

表3 均匀设计试验因素与水平U8(83)Table 3 The factors and levels in uniform design test U8(83)

萃取条件：取3 mL样品于20 mL萃取瓶中，50 ℃平衡20 min，萃取15 min，250 ℃解吸5 min。GC条件：HP-5弹性石英毛细管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；进样口温度250 ℃，升温程序：起始柱温40 ℃保持3 min，以3 ℃·min-1升至160 ℃，保持2 min，然后8 ℃·min-1升至220 ℃，保持3 min。气体流量为1.2 mL·min-1，不分流进样。MS条件：EI电离源；电子能量70 eV；灯丝流量0.25 mA；电子倍增器电压1 000 V；离子源温度230 ℃；接口温度280 ℃；质量扫描范围35～350 u。

1.3 数据处理

采用SPSS 17.0和DPS 7.0软件对试验结果进行数据统计分析，采用origin 9.0进行作图。

2 结果与分析

2.1 枸杞饮料发酵3种乳酸菌生长曲线

OD值的变化反映微生物的生长情况。菌株活性最强的时间段是对数生长期晚期至稳定期初期。如图1所示，嗜热乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李乳糖杆菌活性最强分别在12、12和14 h，当发酵时间超过14 h时，菌株生长进入稳定期。此时测得各乳酸菌的菌落总数，嗜热乳杆菌为(1.69±3)×109CFU·mL-1，植物乳杆菌为(1.22±4)×109CFU·mL-1，鼠李乳糖杆菌为(1.33±2)×1010CFU·mL-1，3种菌均达到了生产要求。

图1 枸杞饮料发酵3种乳酸菌的生长曲线图Fig.1 Growth curves of three LAB in the fermentation for Goji berry beverage

2.2 枸杞饮料发酵3种乳酸菌比例的选择

将嗜热乳杆菌、植物乳杆菌和鼠李乳糖杆菌按照比例接种到枸杞汁中进行发酵，并对其感官性质及活菌数进行评价，结果如表4所示。最终产品的色泽和香气评分均在7～8分，比较受人们喜欢；在口感、酸甜度和整体接受度方面，当V(嗜热乳杆菌)∶V(植物乳杆菌)∶V(鼠李乳糖杆菌)=1∶2∶1时，评分最高均在8分以上，活菌数为(7.8±2)×108CFU·mL-1，高于其他试验组。

①螺孔螺栓接触部位存在异物，在结合处形成卡涩。本次在螺栓拧入前对螺栓及螺孔螺纹进行了仔细检查，记录显示此情况的可能性较小。

2.3 枸杞饮料发酵单因素试验结果

2.3.1 不同乳酸菌接种体积分数对枸杞饮料的影响 由图2可知，随着接种体积分数的增加，总酸和总酚先增加后减少，总糖和类胡萝卜素逐渐减少。在接种体积分数2.0%时总酸和总酚质量浓度最大值分别为0.075 g·L-1、42.4 mg·L-1，总糖、类胡萝卜素质量浓度都比较适中。接种体积分数低于2.0%时产酸较少，是因为菌种数量少，适应周围环境的能力差，生长代谢缓慢。接种体积分数高于2.0%时，乳酸发酵过于迅猛会使溶液中有机酸过高从而抑制乳酸菌的生长。发酵过程中总酚的生成与分解是一个动态过程，接种体积分数过大时多酚的分解聚合会更加频繁，且对类胡萝卜素的降解也更多。综合考虑4个指标，选择乳酸菌接种体积分数2.0%进行下一步试验。

表4 不同菌株比例发酵枸杞汁感官评分及活菌数Table 4 Sensory score and viable count of Lycium barbarum in juice fermented by different strain proportion

图2 不同乳酸菌接种体积分数对枸杞饮料的影响Fig.2 Effects of different LAB inoculation volume fraction on fermented Lycium barbarum beverage

2.3.2 不同发酵时间对枸杞饮料的影响 由图3可知，随着发酵时间的延长，总酸、总酚先增加后减少，总糖和类胡萝卜素都逐渐减少。发酵时间42 h时总酸和总酚质量浓度达到最大值，分别为0.092 g·L-1、40.19 mg·L-1。在42 h之前，发酵液中营养成分含量丰富，乳酸菌生长繁殖快，有机酸得以不断积累，同时体系pH值的降低保证了多酚物质不被分解转化。超过42 h时，总酸和总糖质量浓度都趋于稳定。综合考虑4个指标，选择发酵时间为42 h进行下一步试验。

图3 不同发酵时间对枸杞饮料的影响 Fig.3 Effects of different fermentation time on fermented Lycium barbarum beverage

2.3.3 不同发酵温度对枸杞饮料的影响 由图4可知，在发酵温度范围内，总酸先增加后减少，总酚逐渐增加，总糖和类胡萝卜素均逐渐减少。30 ℃时总酸质量浓度达到最大值0.086 g·L-1。温度低于30 ℃时，乳酸菌生长缓慢，发酵不完全。高于30 ℃时菌种生长迅速，导致菌种过早衰老，乳酸生成量不足。较高温度有利于多酚物质的溶出且不被分解或转化为其他物质，对枸杞饮料风味的提升影响很大。综合考虑4个指标，选择发酵温度为30 ℃进行下一步试验。

图4 不同发酵温度对枸杞饮料的影响Fig.4 Effects of different fermentation temperature on fermented Lycium barbarum beverage

2.4 枸杞饮料发酵均匀设计试验及主成分分析结果

在单因素试验结果的基础上，通过均匀设计试验研究各因素与总酸、总糖、总酚及类胡萝卜素之间的关系，如表5所示。总酸、总糖、总酚及类胡萝卜素的误差都比较小，这说明通过乳酸菌发酵，枸杞饮料的总糖、总酸、总酚及类胡萝卜素4个指标都具有良好的一致性。

表5 枸杞饮料发酵均匀设计试验结果Table 5 Uniform design test results of fermented Lycium barbarum beverage

如表6所示，基于累计贡献率大于80%的原则[22]，通过主成分分析，提取2个主成分时累计贡献率达到82.353%，即提取的2个主成分可以解释全部指标82.353%的信息，说明提取的2个主成分能够全面反映枸杞饮料的品质信息。如表7所示，根据试验指标的特征向量绝对值大小，决定第1主成分大小的指标主要是类胡萝卜素、总糖；决定第2主成分大小的指标主要是总酸、总酚。如表8所示，第4组试验产品的综合得分最低为-1.862 9，第6组试验产品的综合得分最高为1.573 5。

表6 枸杞饮料发酵主成分的特征值、贡献率和累计贡献率Table 6 Eigenvalues,contribution rates and cumulative contribution rates of principal components of fermented Lycium barbarum beverage

表7 枸杞饮料发酵主成分指标的特征向量Table 7 Eigenvector of indicators of fermented Lycium barbarum beverage

表8 枸杞饮料发酵主成分得分值与规范化综合评分Table 8 The scores of principal component and standardized comprehensive scores of fermented Lycium barbarum beverage

2.5 枸杞饮料发酵指标综合得分模型及最佳工艺优化

由表9所示，采用岭回归分析建立指标综合得分模型，综合得分Y=0.192 8+2.158 3Y1+1.184 1Y2，模型相关系数R为0.986 7，R2为0.973 5，模型拟合度较好。

表9 枸杞饮料发酵指标综合得分模型方差分析Table 9 Variance analysis of comprehensive synthetic score model of fermented Lycium barbarum beverage

Y=-3.845 6+9.378 2X1+31.924 2X2+14.152 7X3-48.691 4X1X2-98.192 4X2X2-22.286 0X3X2

Y表示综合评分，X1表示接菌量，X2表示发酵温度，X3表示发酵时间。经计算，决定系数R2为0.977 13，回归模型拟合度较好。根据设定的优化条件，优化各个变量，各自变量的优化值分别为X1=0.027(2.7%)，X2=32.87，X3=40.97，在此发酵条件下枸杞饮料综合评分最高，为3.597 4。综合实际操作考虑调整为X1为2.7%，X2为33 ℃，X3为41 h。经验证试验，计算在此发酵条件下枸杞饮料综合得分为3.428 1，与理论值接近，模型预测基本准确，优化结果可靠。

2.6 发酵前后枸杞饮料的挥发性物质分析

挥发性物质的总离子流图见图5。与标准谱库对比[28]，确定发酵前后枸杞汁中的挥发性风味物质，利用峰面积归一化法计算各物质的相对含量，结果如表10所示。通过GC-MS检测，发酵前后共鉴定出65种物质。发酵饮料的挥发性物质以酯类和醇类为主，分别为37.33%和21.97%。发酵后新增加的物质有18种：2-乙基己醇、乙酸乙酯、硬脂酸乙烯酯、水杨酸甲酯等；相对含量明显增加的成分有6种：正己醇、乙酸乙酯、2-丙基-1-戊醇、二氢紫罗兰酮、甲基庚基甲酮、辛酸，所有物质共同作用组成复合乳酸菌发酵枸杞饮料风味的独特性及复杂性。

图5 发酵前后枸杞饮料中挥发性物质的总离子流图Fig.5 Total ion flow chart of volatile matter in Lycium barbarum beverage before and after fermentation

发酵后酯类化合物总相对含量大幅增加，是对照组的7倍，除甲酸庚酯、邻苯二甲酸二异丁酯含量有轻微降低外，其余物质均上升，还检出了枸杞汁中没有的酯类物质，其中乙酸乙酯的相对含量提高到10.13%，同时检测到大量新的酯类物质，包括相对含量较高的有水杨酸甲酯(2.18%)，十四酸异丙酯(4.27%)，三甲基甲硅烷醇三硅甲烷氧基水杨酯(5.23%)。醇类物质的总相对含量大量增加，增幅较大的有正己醇、2-乙基己醇、2-丙基-1-戊醇、3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇，其他醇类物质有4种含量略微降低，剩余的在发酵后均为检测到。醛类物质的总相对含量降低了13.20%，甲基壬乙醛在枸杞汁中相对含量最高，经发酵后降低至0.27%，发酵饮料中除月桂醛、癸醛外均被检测到，还检测到枸杞汁中不存在的2,3-二氢-2,2,6-三甲基苯甲醛。酮类物质在发酵前后的相对含量略微降低，从9.72%到9.24%，但通过发酵产生了完全不同的种类，其中包括相对含量较高的新酮类物质二氢紫罗兰酮(3.18%)、甲基庚基甲酮(3.26%)，未发酵枸杞汁中含量最高的4-羟基-3-甲基苯乙酮降低至0.05%。酸类物质总含量在发酵过程中大幅增加，包括相对含量较高的辛酸。烯烃类化合物发酵后完全消失，其他类物质在发酵前后相对含量变化很小。总体来说，乳酸菌发酵枸杞汁中醇类、酯类、酸类物质都大幅度增加，醛、酮和烯烃类物质有所降低，与未发酵组相比，发酵后的枸杞汁中物质含量更加丰富。

表10 发酵前后挥发性物质的GC-MS分析结果Table 10 GC-MS analysis of volatile substances before and after fermentation

续表10 发酵前后挥发性物质的GC-MS分析结果Continuing table 10 GC-MS analysis of volatile substances before and after fermentation

注：“-”表示未检出物。

Note:”-” indicates that the component was not detected.

3 结论与讨论

本研究在单因素和均匀设计试验基础上，进行主成分分析，建立指标综合得分模型，通过偏最小二乘回归建模对发酵工艺进行优化。结果表明，菌种的接种体积分数、发酵温度和发酵时间对发酵饮料的品质均有一定的影响。乔博鑫等[24]根据产品的感官评分得到保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌的最佳比例，而本研究添加的嗜热乳杆菌、植物乳杆菌及鼠李乳糖杆菌有所不同，且对饮料品质的评价方式完全不同。不同的发酵剂及其比例和接种体积分数、发酵温度和时间均会影响发酵饮料中微生物的生长及彼此间的竞争和平衡，从而产生不同的代谢产物进而影响饮料的总糖、总酸、总酚及类胡萝卜素还有风味。经优化后的工艺条件为接种体积分数2.7%，发酵温度33 ℃，发酵时间41 h，与张顺[25]、丘裕[26]研究结果大致相同，在此条件下发酵饮料口感适中，发酵风味浓郁，经验证试验，计算综合评分为3.428 1。

发酵后枸杞饮料中的挥发性物质有39种，主要为酯类和醇类，与兰永丽等[27]研究石榴乳酸发酵的结果相似，其基本来自原料和发酵工艺，如乙酸乙酯是在乳酸菌作用下发酵液中的酸和醇反应生成的。正己醇是乳酸菌发酵所独有的，具有水果的芬芳香气[28]。醛类物质多为果香及花香，阈值较低，赋予香气能力较强，但醛类过高可能会有异味[25]。枸杞汁中醛类物质较高，但经乳酸菌代谢后大部分醛类物质被消耗。醛类物质具有一定的芳香气味如β-环柠檬醛具有果香和清香，对风味有一定的辅助作用。酮类有独特的清香和果香风味，并且花香会随着碳链的增长愈发浓厚，对整体风味有补充作用。烯烃类化合物阈值较低，多呈现果香和花香，在未发酵的枸杞汁中含量很高，但发酵后完全消失，与乔博鑫等[24]研究枸杞汁中不含烯烃类物质有所差别，可能是在原料中加入了黑枸杞的原因。发酵枸杞饮料挥发性物质中醇类、酯类的种类及数量明显多于未发酵枸杞饮料，说明发酵工艺可以有效改良产品风味，为新型枸杞发酵饮料的现代化生产提供理论依据。