非洲猪瘟病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立

贾云飞， 赵福杰， 朱静静， 王超群， 吴亚楠， 魏战勇,4

(1.河南农业大学经济与管理学院，河南 郑州 450002；2.河南农业大学牧医工程学院，河南 郑州 450002；3.许昌海关，河南 许昌 461000；4.河南省动物性食品安全重点实验室，河南 郑州 450002)

非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病[1]，最早于1921年在肯尼亚暴发，随后相继扩散至欧洲、中美洲、非洲和亚洲的多个国家[2]。该病临床症状以高热、皮肤发绀、呼吸障碍和神经症状为主，病程短、发病率和死亡率几乎达100%，被世界动物卫生组织(OIE)列为法定报告的动物疫病，也是中国动物病原微生物名录中规定的一类动物传染病[3-4]。中国首例非洲猪瘟疫情2018-08-03在辽宁沈阳暴发[5]，随后疫情持续在中国蔓延，迅速波及大陆地区全部省份，2019-05-10，随着香港上水屠宰场内一头死亡生猪的内脏样本中检测出非洲猪瘟病毒，疫情扩大至香港，给中国生猪养殖业的发展造成了巨大的经济损失，同时也影响着国内猪肉市场的供需稳定。

虽然首次发现ASFV至今已将近100 a，各国科学家也一直致力于ASFV病原及免疫学相关方面的研究，但目前世界上仍没有可有效预防ASFV感染的疫苗，也无有效的治疗药物，仅能依赖有限的抗原检测方法对ASFV感染开展早期诊断，进而通过扑杀感染动物来实现对非洲猪瘟疫情的控制。因此，对ASFV进行快速、准确的诊断在疫情防控方面尤为重要。但是，由于ASF与猪瘟等其他出血性猪病的发病症状非常相似，很难通过临床诊断的方法进行区分，ASF的确诊只能依靠实验室方法。目前，ASFV核酸的PCR和荧光定量PCR检测方法是世界动物卫生组织推荐的抗原检测方法，研究人员建立过多种针对ASFV不同抗原的PCR检测方法。AGUERO等[6]和曾少灵等[7]曾根据ASFVVP72基因设计引物，建立了用于ASFV 早期感染的快速诊断方法；吴忆春等[8]研制了ASFV快速检测PCR试剂盒；BASTO等[9]建立了可用于检测蜱虫体内ASFV的套氏PCR方法；崔尚金等[10]建立了ASFV的高效纳米PCR检测方法；KING 等[11]、李维彬等[12]、张泉等[13]、黄萍等[14]、TIGNON 等[15]、李洪利等[16]多个国内外研究团队先后以ASFVVP72基因为靶基因建立基于TaqMan的ASFV实时荧光定量PCR检测方法；曾少灵等[17]和董志珍等[18]也分别根据ASFVVP73和P54基因建立过 TaqMan 实时荧光定量 PCR检测方法；郭少平等[19]根据 ASFVK205R基因建立TaqMan实时荧光定量 PCR 检测方法；MCKILLEN 等[20]根据9GL基因建立MGB探针实时荧光定量PCR 检测方法。但是这些PCR检测方法的灵敏度和特异性均相对偏低。因此，本研究拟建立一种更加灵敏、准确的ASFV检测方法。

ASFV基因组约170～190 kb，含有151个ORF，可编码150～200种蛋白质[21]。其中，P72基因在不同ASFV间较为保守，因此可被用作ASFV检测中的靶基因。在比对了多株ASFV的P72基因序列后，从中确定了P72基因的保守区域，根据中国动物卫生与流行病学中心分离到的中国流行株ASFV-SY18的序列[4]设计了特异性引物，摸索了各种试验条件后建立了ASFV的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病毒核酸样品及质粒 PEDV、PDCoV、HP-PRRSV和PRV的核酸样品均由河南省动物性食品安全重点实验室提取和保存。连接有ASFVP72目的基因的质粒由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，命名为ASFV-P72-pUC57。其中，目的片段长度417 bp，连于pUC57载体。

1.1.2 主要试剂及仪器 UltraSYBR Mixture购自于北京康为世纪生物科技有限公司；CFX96实时荧光定量PCR仪购自于Bio-Rad公司(美国)。

1.1.3 定量引物的设计与合成 根据1.1.1中合成的标准质粒ASFV-P72-pUC57的基因序列，选取其保守区，应用Primer 5.0基因分析软件设计多对特异性引物，然后在GenBank数据库上用BLAST进行特异性和保守性的比较分析，最终选定的引物序列见表1。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 检测ASFV-P72的相关引物与探针信息

1.2 试验方法

1.2.1 荧光定量RT-PCR反应条件与体系优化 以1.0×105copies·μL-1的标准质粒为模板，反应体系设为25 μL，在反应体系中加入引物P72 F2/P72 R2，使其终浓度分别为0.20、0.40、0.60、1.00 μmol·L-1，根据RT-PCR结果，遵循Ct值最小和荧光阈值最高原则，并确保熔解曲线无非特异性扩增产物，进行引物浓度的优化筛选。将优化后的反应体系分别在Tm±8 ℃内设置50～60 ℃的10个退火温度，进行反应条件的优化，最终确定最佳反应体系与反应条件。

1.2.2 构建标准曲线 计算标准质粒浓度，用ddH2O进行10倍倍比稀释，稀释成10个梯度(1.0×102～1.0×108copies·μL-1)作为模板。采用1.2.1中优化后的反应体系与反应条件进行荧光定量RT-PCR扩增，根据所得的Ct值与对应的标准质粒浓度，绘制标准曲线。

1.2.3 灵敏度试验 以1.0～1.0×109copies·μL-1的标准质粒分别做模板，对SYBR Green I荧光定量PCR方法进行敏感性测定，根据所得熔解曲线，获得其最低检出拷贝数。

1.2.4 特异性试验 按照1.2.1建立的反应体系，分别以PEDV、PDCoV、HP-PRRSV、PRV核酸为模板，同时设1.0×107copies·μL-1的标准质粒为阳性对照，以ddH2O为阴性对照，进行RT-PCR扩增，检测所建方法的特异性。

1.2.5 重复性试验 选取1.0×102、1.0×105、1.0×108copies·μL-1的标准质粒分别作为模板，进行3次批内与批间荧光定量RT-PCR反应扩增，根据Ct值计算变异系数，验证所建方法的可重复性。

2 结果与分析

2.1 反应条件与反应体系优化

最终确定优化后的SYBR Green I实时荧光定量PCR体系为2×UltraSYBR Mixture 12.5 μL, ddH2O 8.5 μL, P72 F2/P72 R2引物各1 μL，标准质粒模板2.0 μL。最佳反应条件为：95 ℃，10 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s；共40个循环；95 ℃，15 s；65 ℃ 至 95 ℃,每0.5 ℃·s-1为间隔绘制熔解曲线。该条件下绘制的熔解曲线峰单一，在熔解温度Tm=(80±0.5) ℃时出现特异性峰，无非特异性扩增产物和引物二聚体，表明该反应特异性良好(图1)。

1. 标准质粒组；2. 阴性对照。1. Standard plasmid group；2. Negative control.

2.2 标准曲线的建立

将建立的SYBR Green I荧光定量PCR方法对1.0×102～1.0×108copies·μL-1的标准质粒进行定量检测，以读取的Ct值为y轴，以标准质粒浓度为x轴绘制标准曲线，获得标准方程y=-3.318 4x+39.085, 相关系数R2=0.999 8(图2)，表明该检测方法的Ct值与10倍倍比稀释的标准质粒之间具有良好的线性关系。

2.3 灵敏性检测

用建立的SYBR Green I荧光定量PCR方法对1.0～1.0×109copies·μL-1的标准质粒进行定量敏感性检测。结果显示该方法的最低检出量为1.0 copies·μL-1(图3)，表明该检测方法均具有极高的灵敏性。

图2 SYBR Green I荧光定量PCR检测方法的标准曲线

2.4 特异性检测

用建立的SYBR Green I荧光定量PCR方法检测PEDV、PDCoV、HP-PRRSV、PRV核酸样品，以1.0×107copy·μL-1标准质粒为阳性对照，发现其余病毒均未出现阳性扩增，并且无非特异性扩增条带(图4)，表明该检测方法具有良好的特异性。

2.5 重复性检测

对建立的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法进行重复性试验。以1.0×102、1.0×105、1.0×108copies·μL-1的标准质粒分别作为模板，进行3次批内与批间荧光定量PCR反应扩增，同一质粒浓度的扩增Ct值在批次内与批次间都非常稳定。计算批内与批间Ct值的变异系数均小于1%(表2)，表明该检测方法具有良好的可重复性。

图3 SYBR Green I荧光定量PCR检测方法的灵敏性检测结果

图4 SYBR Green I荧光定量PCR检测方法的特异性试验结果(A)及熔解曲线分析(B)

表2 SYBR Green I荧光定量PCR检测方法的重复性试验结果

3 讨论

在ASF的检测中，病原PCR检测具有简单、快速、灵敏度高、特异性好等特点，是目前最常用的ASFV实验室检测方法，也是世界动物卫生组织推荐的ASFV抗原检测方法。实时荧光定量PCR具有更高的敏感性和特异性，并且可以用于计算ASFV的相对或绝对含量，也被越来越多地应用到了ASFV的检测工作中，尤其还有学者利用不同病毒的保守基因建立了多重荧光定量PCR检测方法，实现了ASFV和多种其他病原的鉴别诊断。MCKILLEN 等[22]建立了可同时鉴别 PRV、ASFV、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪细小病毒(PPV)的实时荧光定量 PCR 分子信标检测方法；于恒智等[23]建立了可同时鉴别ASFV、小反刍兽疫病毒(PPRV)、西尼罗河热病毒(WNV)、亨德拉病毒(HeV)和尼帕病毒(NiV)等5种外来动物疫病的并联荧光定量PCR检测方法。但是，这些ASFV荧光定量检测方法几乎都是TaqMan探针法，操作中需要用到荧光标记的探针，价格昂贵导致检测成本很高，而本研究建立的SYBR Green I荧光定量检测方法可以免于合成探针从而降低检测成本，并且检测灵敏性达到了1.0×100copies·μL-1，明显优于世界动物卫生组织推荐的PCR检测方法。

除了检测灵敏度极强以外，本研究建立的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法的特异性和重复性结果显示也很好，可以准确地从含猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒等病原的样品中鉴别检测出ASFV。此外，本研究中用到的检测基因P72，在ASFV毒株间序列相对保守，是ASFV荧光定量PCR检测中的常用检测基因，常被用于ASFV诊断和鉴别检测方法的建立中；标准质粒序列来源于CN201801病毒株(GenBank：MH722357.1)，它是由中国动物卫生与流行病学中心于2019年分离鉴定的中国ASF疫情的流行毒株，该病毒株的P72基因序列与格鲁吉亚Georgia 2007/1分离株、俄罗斯 Krasnodar 2012和Irkutsk 2017分离株、 以及爱沙尼亚Estonia 2014分离株的P72序列有100% 相似性，同属于ASFV 基因型II型毒株，与其他基因型的ASFV毒株存在一定的序列差异[4]。因此，基于此毒株基因序列设计的特异性引物，对中国临床样品的检测有更高的特异性，可以更加准确地对中国目前流行的非洲猪瘟病毒株进行检测和诊断。

本研究成功建立了一种基于SYBR Green I的ASFV荧光定量PCR检测方法，且灵敏性、特异性和重复性都较好，可用于中国非洲猪瘟的准确诊断及病原的定量分析，有助于国内ASFV疫情的监测和防控。