郑麦369 ω-醇溶蛋白基因的克隆及生物信息学分析

柳东阳， 周正富， 吴政卿， 李文旭， 晁岳恩， 徐福新， 雷振生，

(1.河南农业大学，河南 郑州 450002； 2.河南省农业科学院小麦研究所，河南 郑州 450002)

小麦子粒蛋白主要由清蛋白、球蛋白和面筋蛋白组成，面筋蛋白作为种子储藏蛋白，约占小麦子粒蛋白的80%。面筋蛋白决定着面粉的加工品质，可分为麦谷蛋白和醇溶蛋白，前者赋予面团弹性，后者赋予面团黏性和延展性[1]。酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术是分离醇溶蛋白最常用的方法，根据电泳迁移率的不同，可将其分为3类：α/β-，γ-和ω-醇溶蛋白，分别占其总量的55%，30%和15%[2-3]。其中ω-醇溶蛋白主要由大量谷氨酰胺、脯氨酸和苯丙氨酸组成，占氨基酸残基总数的80%；ω-醇溶蛋白缺少甲硫氨酸和半胱氨酸，故又将其称作贫硫醇溶蛋白[4-6]。有研究表明，所有ω-醇溶蛋白基因由位于第1部分同源染色体的短臂上的Gli-1位点编码[4,7-8]。普通小麦中ω-醇溶蛋白基因有15～18个拷贝，但大多数被认定为是假基因[9-10]。ω-醇溶蛋白的基本结构可分为4个区域：19个氨基酸残基组成的信号肽、10～11个氨基酸残基组成的非重复性N-末端、90%～96%的氨基酸组成的重复区域和10～11个氨基酸残基组成的C-末端[11-13]。根据翻译后N端序列的不同，可分为ARQ/E-，KEL-，SRL-和TRQ-4种类型[9]。已有研究表明，前2种类型的ω-醇溶蛋白基因(ARQ/E，KEL型)位于小麦1A，1D染色体上，所编码的蛋白分别属于ω-1和ω-2醇溶蛋白；SRL-型基因位于1B染色体上，编码的蛋白属于ω-5醇溶蛋白[14]。研究表明，ω-醇溶蛋白基因等位变异对面团特性的作用，是因为受到与Gli-1位点紧密连锁的Glu-3位点的影响[15]。不同Gli-B1位点对小麦品质的作用不同，其中Gli-B1k小麦面团强度起显著负向作用，而Gli-B1b位点小麦面团强度起正向作用[16]。BRANLARD等[17]研究证明，Gli-D1位点对小麦加工品质的影响是正向效应。WANG等[18]利用高效毛细管电泳和反相高效液相色谱技术，对113个小麦品种的醇溶蛋白进行研究发现，Gli-D1 位点与面团强度和面包体积密切相关。有研究表明，ω-醇溶蛋白谱带ω11，ω13.5，ω16，ω20，ω30，ω32，ω37与小麦面筋弹性、黏性、延展性及膨胀性呈正相关，ω2，ω4，ω14，ω19与小麦面筋强度呈显著正相关[19-20]。但有研究表明，ω-醇溶蛋白因不能形成分子间二硫键，对小麦加工品质的影响相对较小，3种醇溶蛋白均能显著增加面包体积，ω-醇溶蛋白对面包体积的增加却最小，而对面筋强度的降低作用最强[21-23]。此外，ω-醇溶蛋白是一种可以诱发由T-细胞介导慢性遗传性疾病——乳糜泻(celiac disease，CD)的主要外在刺激蛋白。ENSARI等[24-25]研究表明，乳糜泻患者服用纯化的ω-醇溶蛋白后，体内黏膜淋巴细胞会明显增多，表明ω-醇溶蛋白可以诱发免疫反应进而损害小肠上皮细胞，并确定了3种可诱发CD发生的T-细胞免疫肽段，即Gli-ωt：PQQPFPQQ，Gli-ω1：PFPQPQQPF，Gli-ω2：PQPQQPFPW。本研究以黄淮麦区主推小麦品种郑麦369为材料，利用简并引物和PCR扩增技术对其ω-醇溶蛋白基因进行克隆和序列分析，以期明确其基因组内ω-醇溶蛋白基因的数量和特征，为ω-醇溶蛋白功能研究和小麦品质改良提供遗传基础资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究所用材料是小麦品种郑麦369。该品种为半冬性小麦品种，2017年完成国家黄淮冬麦区南片冬水组试验程序，2018年通国家农作物品种审定委员会审定。由河南省农业科学院小麦研究所丰优育种室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA提取及PCR扩增 郑麦369种子在室温、黑暗条件下萌发15 d后，用Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒(生工生物工程有限公司)提取幼苗的基因组DNA。基因组DNA经过RNase处理后，将质量浓度调整到50 mg·L-1，备用。根据GenBank中已发表ω-醇溶蛋白基因序列的保守性，设计7对简并引物(表1)，引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。选用高保真聚合酶phusion.HS.Ⅱ.pdymerase进行PCR扩增。PCR扩增程序为：98 ℃预变性30 s；98 ℃变性10 s，65 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。为了确保扩增的忠实性，本试验在PCR反应体系中选用的是高保真聚合酶phusion.HS.Ⅱ.pdymerase，以及较高的退火温度。

表1 ω-醇溶蛋白基因克隆的保守引物Table 1 Conserved primers for ω-gliadin gene cloning

1.2.2 PCR产物纯化及克隆测序 扩增产物经1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测，然后用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(生工生物工程有限公司)对目的片段进行回收及纯化。随后将回收的PCR产物连接到pEASY-Blunt3 Cloning Vector(北京全式金生物技术有限公司)载体上，并转化到大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞中，随机挑选一定数量的单菌落，通过菌液PCR鉴定阳性克隆，酶切验证后送上海生物工程技术服务有限公司测序。

1.2.3 序列分析、CD毒性肽识别和系统进化树构建 序列检测结果用DNA STAR Lasergene7进行序列拼接分析。应用FGENESH在线软件进行基因结构分析和氨基酸序列预测。利用NCBI提供的在线BLAST(http：//www．ncbi．nlm．nih．Gov/BLAST)工具对测序得到的序列进行同源序列搜索；利用Bioedit 7.0软件进行核苷酸与推导氨基酸的多序列比对；根据CICCOCIOPPO等[26]和VACCINO等[27]的方法识别克隆基因所编码的3种T细胞免疫肽。

从NCBI数据库中分别下载乌拉尔图小麦(Triticumurartu,AA)、拟斯卑尔脱山羊草(Aegilopsspeltoides,BB)和粗山羊草(Aegilopstauschii,DD)的ω-醇溶蛋白基因序列，采用MEGA 6.0软件，应用N-J法构建本研究克隆得到的ω-醇溶蛋白的系统进化树，Bootstrap 值设为1 000。

2 结果与分析

2.1 郑麦369 ω-醇溶蛋白基因的克隆及核苷酸序列分析

以郑麦369基因组DNA为模板，利用7对引物通过PCR扩增获得 6条核苷酸片段(图1)。将PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分离后回收纯化，纯化产物连接到pEASY-Blunt3 Cloning Vector载体后转化到大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞中。经PCR扩增和限制性内切酶鉴定后，挑取出200多个克隆进行全长测序。测序结果表明，共得到15条非重复序列(分别命名为ZM369-1～ZM369-15)，序列长度变化范围为603～1 221 bp(表2)，其中ZM369-2序列长度最短；ZM369-15序列长度最长；ZM369-4～ZM369-8序列长度相同,均为1 080 bp；ZM369-10～ZM369-14序列长度相同,均为1 116 bp。BLAST分析表明，克隆获得的15条序列与GenBank中已知的ω-醇溶蛋白基因序列的相似度变化范围为82%～99%(表2)。

图1 郑麦369 ω-醇溶蛋白基因的PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification of ω-gliadin genes in Zhengmai 369

2.2 郑麦369 ω-醇溶蛋白氨基酸序列及CD毒性肽分析

由FGENESH在线软件预测(表2)，在克隆获得的15条核苷酸序列中，ZM369-1和ZM369-15具有完整的开放阅读框，且不存在内含子，分别可编码318，407个氨基酸残基，推测其可编码ω-醇溶蛋白；ZM369-2～ZM369-14均因序列内部提前出现1个或多个终止密码子，推测其为假基因。

与已知ω-醇溶蛋白的核苷酸序列进行比对发现(图2)，本研究获得的15个ω-醇溶蛋白基因所推导的氨基酸序列均具有ω-醇溶蛋白典型的分子结构特征，即由19个氨基酸组成的信号肽、由11个氨基酸组成的N-末端区、由90%～96%的氨基酸组成的可变重复区和由11个氨基酸组成的C-末端区。与已报道的多数ω-醇溶蛋白基因类似，15条序列在中央重复区富含脯氨酸(Proline，P)、谷氨酰胺(Glutamine，Q)和苯丙氨酸(Phenylalanine，F)，并且n(Q)∶n(P)∶n(F)为4∶3∶1(表2)，同时明显缺乏含硫氨基酸，即缺乏半胱氨酸(Cysteine，C)和甲硫氨酸(Methionine，M)，仅ZM369-15在重复区含有1个半胱氨酸。

表2 克隆得到的15个ω-醇溶蛋白基因的比较分析Table 2 Comparative analysis of the 15 ω-gliadin genes recovered in this study

ω-醇溶蛋白的前3个氨基酸决定着它的类型。本研究得到的15条氨基酸序列有ARP，ARE和ARQ3种类型(图2)：ZM369-1～ZM369-2，ZM369-4～ZM369-14属于ARQ型，ZM369-3属于ARE型，ZM369-15属于ARP型，其中ARP型在前人的研究报告中未曾报道过。序列N端和C端的氨基酸变异都是由碱基突变造成的，在N端，编码第3个氨基酸的三联核苷酸的的第2个核苷酸A突变成C就会导致Q被P取代；多条序列在N端第7个氨基酸处发生变异，编码此氨基酸的第2个核苷酸G突变成A就会导致丝氨酸(L-Serine，S)被天冬酰胺(Asparagine，A)取代。相对于其他序列，ARP类ω-醇溶蛋白ZM369-15在N端变异的位点较多。已知的ω-醇溶蛋白氨基酸序列在氨基酸序列在C端差异较大，不同的基因序列都有自己专属的C端。本研究克隆的序列也有同样的表现。

由于重复单元的存在，所以重复区是决定ω-醇溶蛋白基因多态性的重要区域，序列之间在重复区的差异既有片段的插入或缺失，又有氨基酸的替换。如图2所示，在15条氨基酸序列中，ZM369-1在93 bp处存在1个44 bp的片段缺失；ZM369-2在213 bp处存在1个210 bp的长片段缺失；ZM369-3在215 bp处存在1个93 bp的片段的缺失；ZM369-9在296 bp处存在1个含有终止密码子的5 bp片段插入；ZM369-15在58，74，114，168，202，246 bp处分别存在1个2，6，3，3，7，4 bp的片段插入，其中在246 bp处所插入的片段中含有1个半胱氨酸。ZM369-4～ZM369-14存在高度的相似性，只存在少数几个位点氨基酸的差别。ZM369-1，ZM369-2，ZM369-3和ZM369-15与其他氨基酸序列差别较大，在多个位点既存在片段的插入和缺失，又存在氨基酸的替换。

ZM369-1和ZM369-15均具有ω-醇溶蛋白典型结构特征，在NCBI数据库中没有找到与它们相似度高的ω-醇溶蛋白氨基酸序列。其中与ZM369-1相似性最高的是AGZ20258，片段覆盖率仅有9%；与ZM369-15相似性最高的是AKA88518，片段覆盖率仅有5%。由此推测，ZM369-1和ZM369-15为新ω-醇溶蛋白基因。

CD毒性肽的识别分析表明(图2)，免疫肽段Gli-ω1(PFPQPQQPF)在真基因ZM369-1和ZM369-15中未见分布，但在假基因中均有分布，位于同一位点且只有1个拷贝；免疫肽段Gli-ω2(PQPQQPFPW)在15条序列中均未见分布；免疫肽段Gli-ωt(PQQPFPQQ)在克隆的15条序列中均有分布，其中ZM369-1，ZM369-15分别存在4，5个拷贝，13个假基因中存在1～5个数目不等的拷贝。

注：红、黄、绿颜色框分别表示T细胞免疫肽Gli-ω1,Gli-ω2,Gli-ωt分布位置；黑颜色框表示额外的半胱氨酸残基分布位置。

Note：The red, yellow and green color frames indicate the distribution of t cell immunopeptide gli-ω1, gli-ω2, gli-ωt, respectively; the black color box indicates the additional distribution of cysteine residues.

图2 郑麦369 ω-醇溶蛋白与2个已知的典型ω-醇溶蛋白氨基酸序列的多重比对
Fig.2 Multiple alignment of the deduced amino acid sequences of l5 novel genes cloned in this work and 2 typica ω-gliadin genes in the public database

2.3 郑麦369 ω-醇溶蛋白基因的系统进化分析

为明确克隆得到的郑麦369的ω-醇溶蛋白基因与普通小麦祖先二倍体小麦亲缘关系，在NCBI数据库中下载乌拉尔图小麦、拟斯卑尔脱山羊草和粗山羊草ω-醇溶蛋白基因。用这些基因推导的氨基酸序列，应用MEGA6.0软件,采用N-J法构建它们与本研究克隆得到的15条ω-醇溶蛋白氨基酸序列的系统进化树(图3)。图3显示，所有的ω-醇溶蛋白基因可成了为2 类：GroupⅠ和GroupⅡ。

Group Ⅰ包含1个乌拉尔图小麦的ω-醇溶蛋白基因、2个来自粗山羊草的ω-醇溶蛋白基因和本研究获得的15个ω-醇溶蛋白基因。根据相似度高低，Group Ⅰ可以进一步分为3个亚组Sub 1-1，Sub 1-2和Sub 1-3，其中Sub 1-1亚组包含ARQ类型的ZM369-2，ZM369-4～ZM369-14；Sub 1-2亚组分为2个小分支，1支包含ARE类型的ZM369-3和1个来自粗山羊草的ω-醇溶蛋白基因，另一分支包含ARQ类型的ZM369-1、1个来自粗山羊草的ω-醇溶蛋白基因和1个来自乌拉尔图的ω-醇溶蛋白基因；Sub1-3亚组包含类型为ARP的ZM369-15和1个来自乌拉尔图的ARH类型ω-醇溶蛋白基因。结果表明，N端第1个氨基酸为丙氨酸(Ala)的ω-醇溶蛋白基因均聚在了Group Ⅰ中，包括ARQ，ARE，ARH和ARP4种类型。

Group Ⅱ包含10个来自粗山羊草和2个来自拟斯卑尔脱山羊草的ω-醇溶蛋白基因。根据相似度高低，Group Ⅱ可以进一步分为2个亚组Sub 2-1和Sub 2-2。其中Sub 2-1亚组包含TRQ类型的拟斯卑尔脱山羊草ω-醇溶蛋白基因，Sub 2-2亚组中包含分别聚集在2条小分支上的SRQ和TRQ类型的粗山羊草ω-醇溶蛋白基因。同一类型但不同基因组来源的ω-醇溶蛋白基因分别聚集在不同亚组，说明其具有一定的基因组特异性。

在Group Ⅰ和Group Ⅱ中均含有粗山羊草ω-醇溶蛋白基因，表明其在进化过程中存在着广泛的变异，但其又分别与相同类型ω-醇溶蛋白基因聚集在同一分支上，由此推测ω-醇溶蛋白基因类型可能与进化有关。

研究表明，ARQ/E，KEL类型的ω-醇溶蛋白基因位于小麦1A,1D染色体上，所编码的蛋白分别属于ω-1和ω-2醇溶蛋白；SRL-型基因位于1B染色体上，编码的蛋白属于ω-5醇溶蛋白[15]。ZM369-1～14均属于ARQ/E类型醇溶蛋白基因，与乌拉尔图和粗山羊草的ω-醇溶蛋白基因具有相对较近的进化关系，表明其来源于A，D基因组，与POENA等[15]的报道一致。新类型ARPω-醇溶蛋白基因ZM369-15与乌拉尔图ARH类型ω-醇溶蛋白基因具有相对较近的进化关系，推测其可能也是来源于A基因组。

图3 郑麦369ω-醇溶蛋白基因与二倍体小麦ω-醇溶蛋白基因的系统进化树分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis of the ω-gliadin genes of Zhengmai 369 and the ω-gliadin gene of diploid wheat

3 结论与讨论

目前，除HSIA等[13]采用筛选基因组文库法得到少量ω-醇溶蛋白基因外，利用PCR技术获得的ω-醇溶蛋白基因很少，且大多为假基因[5,11,13,28-34]，因此，对于更多新的ω-醇溶白基因的克隆及分析显得尤为重要。本研究根据Genebank中的已发表ω-醇溶蛋白基因以及序列的保守性，设计了7对简并引物，在扩增过程中对扩增条件进行多次尝试与优化，最终选择了试验方法中用到的引物及扩增条件。以郑麦369 DNA基因组为模板扩增出15个具有典型分子结构的ω-醇溶蛋白基因，包括2个真基因和13个假基因，这与已有研究的ω-醇溶蛋白基因有15～18个拷贝相符[9-10]。

对得到的15个ω-醇溶蛋白基因推导的氨基酸序列比对分析得出，15条序列在中央重复区富含脯氨酸、谷氨酰胺和苯丙氨酸，并且n(Q)∶n(P)∶n(F)为4∶3∶1，大部分ω-醇溶蛋白基因都不含硫氨基酸，即缺乏半胱氨酸和甲硫氨酸，与已有研究一致[4-6]。ZM369-15在重复区含有1个半胱氨酸。KASARDA[35]曾在研究中提出，含有奇数个半胱氨酸残基的醇溶蛋白在形成分子内的二硫键后，会剩下一个额外的半胱氨酸残基，其会参与形成分子间二硫键。因此，推测ZM369-15这样的变异可能会使其分子内二硫键参与到分子聚合中，进而对小麦品质产生一定的作用。此外，以后可以利用ZM369-15设计引物扩增含硫氨基酸的ω-醇溶蛋白，在对更多的含硫ω-醇溶蛋白研究的同时，还可以将其转入普通小麦替换贫硫ω-醇溶蛋白。

ZM369-1和ZM369-15均具有ω-醇溶蛋白典型的分子结构特征，在NCBI数据库中没有找到与它们相似度高的ω-醇溶蛋白氨基酸同源序列，其中ZM369-15属于之前未曾报道过的ARP类型。由此推测，ZM369-1，ZM369-15为新的ω-醇溶蛋白基因。

DUPONT等[14]研究表明，ARQ/E，KEL类型的ω-醇溶蛋白基因位于小麦1A，1D染色体上，所编码的蛋白分别属于ω-1和ω-2醇溶蛋白；SRL-型基因位于1B染色体上，编码的蛋白属于ω-5醇溶蛋白。本研究获得的基因ZM369-1～14均属于ARQ/E类型，由进化树分析可知，与乌拉尔图与粗山羊草的ω-醇溶蛋白基因具有相对较近的进化关系，表明其来源于A，D基因组，与DUPONT等[14]的报道一致。新类型ARP基因ZM369-15与ARH类型乌拉尔图具有相对较近的进化关系，推测其可能也是来源于A基因组。

根据系统进化树分析还发现，相同类型的ω-醇溶蛋白基因可形成相对集中的分支，推测ω-醇溶蛋白基因型可能与进化相关。相同基因组来源的ω-醇溶蛋白基因也大都可形成相对集中的分支，表明ω-醇溶蛋白基因具有一定的基因组特异性。