基于非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的菜心SCoT 分析

史卫东，罗海玲，康红卫，琚茜茜，张 力

(广西农业科学院蔬菜研究所，广西 南宁 530007)

菜心(Brassica rapavar.parachinensis)是华南地区栽培面积较大的叶菜之一，其虫害危害较大，开展菜心抗虫性研究具有重要的生产意义。杂交育种是创制和丰富抗性种质的重要途径，前期利用抗、感小菜蛾菜心资源杂交培育F2分离群体，利用目标起始密码子多态性分子标记(Start codon targeted polymorphism, SCoT)检测抗虫性亲本及部分子代分离株系的遗传多样性变化，结合cDNA-AFLP 分析，获得与白菜防御和大白菜花蕾败育相关的TDF[1—2]。鉴于cDNA-AFLP 分析具有周期较长、费用较高、技术水平要求较高等缺点，采用周期较短、费用较低、简便高效、适于批量检测的SCoT 分析更符合育种实践和理论研究需求。

SCoT是基于基因ATG翻译起始序列及其侧翼序列多态性的分子标记，这些基因组序列在不同物种间的保守性、重复性、与目标性状关联性均较高，已成为一种功能性分子标记[3—4]。SCoT标记的条带不多，利用琼脂糖电泳检测具有制胶和显影操作简单的优点，但琼脂糖凝胶存在分辨率偏低、胶板较短、条带易堆叠、克隆大片段时容易割取分离、小片段及相差不大的片段不易分离等问题，影响测序结果。研究表明，利用6%变性聚丙烯酰胺凝胶能完全区分牛鞭草(Hemarthriasp.)品种的SCoT多态性[5]，SCoT标记也能检测甜橙(Citrus sinensis)基因组的单碱基缺失与替换[6]。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳适用于DNA或RNA等生物大分子的检测，分辨率可达2个碱基，常用于微卫星DNA多态性的检测，特别是当样本量少或SSR位点变异小时，检测更为准确[7]。本研究利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测前期获得的6份菜心F2株系，克隆差异片段，以规避cDNA-AFLP克隆的限制因素，并结合基因结构和比对分析，探讨基于非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析的SCoT多态性，为菜心抗虫性育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验于2017 年3 月23 日在广西农业科学院蔬菜研究所科研基地进行。以菜心抗虫亲本Caixin65和感虫亲本Caixin69 及其6 份F2分离株系h5、h6、h7、h8、h14 和h15 为材料，按株系种植，在齐口花期采集叶片保存于-20 ℃冰箱备用。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取

利用杭州博日基因组DNA 试剂盒提取。

1.2.2 SCoT 分析

优 化 后 的PCR 体 系20 μL，含1.5 mmol·L-1MgCl2、0.5 μmol·L-1引物、0.5 mmol·L-1dNTPs、1.25 UTaqDNA聚合酶、50 ng基因组DNA。PCR程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，共35个循环；72 ℃延伸5 min。21条引物序列见表1[1]。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳(1×TAE buffer)，在紫外凝胶成像系统上拍照保存。

1.2.3 非变性聚丙烯酰胺凝胶制备及电泳

8%非变性聚丙烯酰胺凝胶(Acr:Bis=37.5:1；120 mL)：将40% Acr 24 mL、2% Bis 12.84 mL、10×TBE(pH 8.3) 12 mL和ddH2O 70.8 mL，混合均匀后灌胶，120 W恒功率预电泳30 min，将DNA样品与缓冲液混合后取5～7 μL上样，120 W恒功率电泳5 h，待溴酚蓝至胶的四分之三处终止。剥离胶放入1 L银染液(0.1% AgNO3)中摇12～15 min；转移至1 L H2O中清洗30 s；取出，转移至1 L显影液(1 L H2O+0.4 g Na2CO3+0.2 g Na2B4O7+20 g NaOH)中，用前加3 mL甲醛，摇床轻摇，显色至条带清晰为止；再水洗2次，每次3 min。凝胶取出后放在白背景的塑料板上照相，割取差异片段。

1.2.4 差异片段回收及克隆测序

将切下的聚丙烯酰胺凝胶目的带中加入50 μL TE buffer，50 ℃温育2 h，作为DNA模板进行PCR反应。PCR反应体系40 μL，含康为世纪2×EsTaqMaster Mix 20 μL，10 µmol·L-1Forward primer 1 μL，10 µmol·L-1Reverse primer 1μL，DNA 5 μL，ddH2O 13 μL。反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35个循环；72 ℃延伸5 min。利用杭州博日Biospin胶回收试剂盒回收目的条带。连接pMD19-T Vector载体，16 ℃连接过夜，转化DH5α感受态细胞。菌落PCR反应体系20 μL，含2×EsTaqMaster Mix 10 μL，10 µmol·L-1M13(47) primer 0.5 μL，10 µmol·L-1M13(48) primer 0.5 μL，ddH2O 9 μL。反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环；72 ℃延伸5 min。挑取单克隆由广州擎科生物技术有限公司双向测序。

1.3 统计分析

将琼脂糖凝胶的每一条SCoT 带视为一个多态性位点，有带记为“1”，无带记为“0”，格式以0 与1 矩阵保存。利用GenAlEx 6.5 软件计算多态性百分率(Percentage of polymorphic loci，P)、观察等位基因数(Observed number of alleles，Na)、有效等位基因数(Effective number of alleles，Ne)，Nei’s 遗传多样性指数(Nei’s gene diversity，He)、Shannon信息多样性指数(Shannon’s information index of diversity，I)等遗传多样性指数。利用GENSCAN(http://genscanw. biosino.org/)预测基因结构，初步确定基因功能等信息，利用NCBI 的BLASTN 检索同源序列信息。

2 结果与分析

2.1 引物筛选

利用 21 条 SCoT 引物扩增菜心抗虫亲本Caixin65 和感虫亲本Caixin69。结果显示，引物SCoT25 未能扩增出条带，其他20 条引物均能在亲本间检测出条带，但多态性条带较少，因此20 条引物全部用于后续多态性检测(图1)。

2.2 非变性聚丙烯酰胺凝胶检测菜心SCoT 多态性

利用20 条引物扩增亲本Caixin65 和Caixin69及6 份F2株系，一共扩增出331 条带，多态性条带217 条，多态性百分率为66%。不同的SCoT 引物检测效率相差较大，最低的SCoT4 和SCoT21 仅有36.36%，最高的SCoT16 可达89.29%，平均每个引物在非变性聚丙烯酰胺凝胶上可扩增出17 条带，多态性条带11 条(表2)。片段分布于100 bp 至2000 bp之间(图2)。非变性聚丙烯酰胺凝胶大大提高了SCoT 多态性检测效率。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

图1 菜心亲本Caixin65 和Caixin69 的21 个SCoT 引物多态性Fig. 1 The amplification profile of parents Caixin65 and Caixin69 with 21 SCoT primers

2.3 SCoT3 和SCoT4 引物的琼脂糖电泳和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳比较

选用非变性聚丙烯酰胺凝胶上总条带数较少的SCoT3 和SCoT4 引物扩增菜心亲本Caixin65 和Caixin69 及6 份F2株系。结果显示，在琼脂糖电泳上SCoT3 扩增出3 条，SCoT4 扩增出6 条，条带数量较少且不清晰(图3)，而非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳显示SCoT3 扩增出8 条带，SCoT4 扩增达11 条，条带数量比琼脂糖电泳多且清晰(图2)，结果表明两种电泳扩增效率差别较大，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳效率高于琼脂糖电泳。

表2 SCoT 引物非变性聚丙烯酰胺凝胶检测多态性Table 2 The results of non-denatured polyacrylamide gel electrophoresis with SCoT primers

2.4 遗传多样性分析

利用GenAlEx 6.5 软件分析8 份菜心的遗传多样性，8 份菜心的多态性条带百分率变幅为(46.43%～100.00%)，平均为70.54%，观察等位基因数(Na)变幅为0.929～2.000，平均为1.433；有效等位基因数(Ne)变幅为1.257～1.479，平均为1.323；Shannon 多样性指数(I)变幅为0.228～0.450，平均为0.301；期望杂合度(He)变幅为0.151～0.290，平均为0.194，遗传多样性指数变化大的均发生于h14 和h15 株系之间，其余4 个子代的遗传变化介于亲本间(表3)，表明h14 和h15 子代间发生了较大的遗传变异。

2.5 菜心SCoT 多态性条带克隆及分析

选取亲本的10 条非变性聚丙烯酰胺凝胶差异片段克隆，获得4 条感虫相关序列S3-4-1、S5-4-1、S12-4-1 和S3-4-2(引物简写-亲本编号-片段序号，下同)，6 条抗虫相关序列S4-5-1、S10-5-1、S21-5-1、S28-5-1、S34-5-1 和S35-5-1。菜心与拟南芥同为十字花科植物，基因组同源程度较高，因此以拟南芥作为参考，采用在线基因预测软件GENSCAN 检索这10 条SCoT 序列，其他参数均为缺省(表4)。结果表明，8 条具有启动子、终止子、阅读框等基因部分序列，除了S10-5-1 只有终止子外，其余7 条都包括启动子，S12-4-1 包括反向链的启动子，S3-4-1和S10-5-1 两个有终止子没有阅读框，S12-4-1 和S21-5-1 两个有启动子没有阅读框，表明这7 条序列的SCoT 多态性主要源于启动子区域，因而SCoT的保守性和重复性较好。除了S35-5-1 外，S3-4-1、S3-4-2、S4-5-1、S5-4-1、S10-5-1、S12-4-1、S21-5-1、S28-5-1、S34-5-1 分别编码67、13、34、86、83、57、79、121、113 个氨基酸的蛋白，表明SCoT 序列可能参与蛋白质翻译过程，与基因功能有关。外显子真实性的概率大小的P值是根据一个外显子与相邻外显子的匹配程度来估计的。0.5＜P＜0.99 意味着中等可能性的外显子，除 S10-5-1 外，其余7 条序列的外显子P值均在此范围内，表明7 条SCoT序列包括外显子的可能性较大。

图2 SCoT 引物的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图Fig. 2 The non-denatured polyacrylamide gel electrophoresis with SCoT primers

图3 引物SCoT3 和SCoT4 琼脂糖电泳图Fig. 3 The agarose gel electrophoresis with SCoT3 and SCoT4 primers

表3 8 份菜心的SCoT 遗传多样性信息Table 3 The genetic diversity index of flowering Chinese cabbage cultivars and F2 segregating lines

表4 8 条SCoT 序列GENSCAN 预测结果Table 4 The GENSCAN results of 8 SCoT sequences

10 条序列的BLAST 相似性检索表明，从感虫亲本Caixin69 获得的S3-4-1 是泛素羧基末端水解酶mRNA 序列，S5-4-1 是大白菜克隆KBrB026J02 序列，S12-4-1 推测是白菜线粒体丙酮酸载体蛋白2 mRNA 序列，S3-4-2 是甘蓝基因组编码未知蛋白的HDEM genome scaffold C3 序列。从抗虫亲本Caixin65 获得的S4-5-1 是白菜RNA 假尿苷合酶4线粒体mRNA 序列，S21-5-1 是京水菜线粒体DNA序列，S28-5-1 推测是白菜位置蛋白LOC103870677 mRNA 序列，S34-5-1 推测是白菜4-香豆酸：辅酶A连接酶-类8 转录变体X2 的mRNA 序列，S35-5-1是大白菜克隆KBrB017P15 序列，S10-5-1 是哈茨木霉CBS226.95 推测蛋白mRNA 序列(表5)。

表5 10 条SCoT 同源基因片段的相似性比对Table 5 The blast results of 10 SCoT sequences

3 讨论与结论

对哲罗鱼(Hucho taimen)和玉米(Zea mays)的变性与非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行比较发现，变性凝胶的条带清晰，易于鉴定[8—9]，非变性凝胶有较多的非特异性条带，但目的条带明亮，带型清晰准确、结果可靠[9]。本研究利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的菜心SCoT 多态性，低于同一群体基于变性胶的cDNA-AFLP 多态性[2]。cDNA-AFLP 分子标记源自mRNA、单拷贝和多拷贝等[10]，是由随机多引物扩增的全基因组RNA 酶切多态性；SCoT标记是单引物的翻译起始位点的DNA 多态性，多态性不比cDNA-AFLP 丰富，但本研究直接挖取SCoT差异片段捣碎做PCR，获得的10 个位点序列中9个具有相关的生物信息学信息，7 条序列的SCoT 多态性主要源于启动子区域，利用SCoT 标记克隆基因克隆的效率似乎高于cDNA-AFLP[2]，比常用的非变性聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA 的煮沸法、改良煮沸法和水浴法(直接洗脱法)更加简单高效[11—12]，比较适合批量差异片段分离。

本研究利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳仅检测了6 份F2株系，非变性聚丙烯酰胺凝胶比琼脂糖的条带多，检测效率更高。遗传多样性分析表明，2个子代株系发生了较大的遗传变异，其余4 个株系的遗传变化介于亲本间，与该群体的琼脂糖电泳检测结果一致[1]，表明非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳更适于SCoT 标记分析。

前期利用cDNA-AFLP 标记仅获得1 个与白菜防御相关基因高度同源的TDF[2]。本研究的菜心SCoT 序列具有启动子、终止子、阅读框等基因序列，SCoT 多态性主要源于启动子区域，因而保守性和重复性较好，并可能与基因功能有关。假尿苷是转录过程中数量较多的一种RNA 修饰，具有多种生物学功能。在所有的snRNA 中基本上都发生了假尿苷修饰，且该修饰在物种之间有较高的保守性[13—14]，snRNA 中的假尿苷也主要聚集分布在功能重要的区域[15]。木质素是植物体中仅次于纤维素的一种重要大分子有机物质，在生长发育和抗性方面具有重要的生物学功能[16—17]。4-香豆酸:辅酶A 连接酶作用于苯丙烷类代谢途径的第3 个步骤，是联系木质素前体和各个分支途径的纽带，在木质素单体合成过程中发挥了重要的调控作用[18—19]，也是植物次生代谢途径的调控基因[20—21]，病虫害、机械伤害、紫外线等都会影响其在特定组织器官中的表达[22—23]。哈茨木霉至少对18 属29 种病原真菌在体外或体内表现出拮抗作用，对番茄幼苗猝倒病菌、褐斑病菌、水稻恶苗病菌有强烈的拮抗作用[24—27]。

本研究基于非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的SCoT 分析，提高了SCoT 标记清晰度、遗传多样性检测水平和差异片段克隆的精准性，使得SCoT 不仅成为简单有效的遗传多样性检测手段，也成为批量克隆差异片段的有力工具，有助于深入挖掘SCoT功能性标记信息，开展初步的功能基因组学研究，提高优异株系筛选鉴定效率，加快育种进程，为菜心抗虫性机制研究提供理论基础。