Ag/石墨烯复合涂层的制备及抗菌性能

田惠博, 张 强, 闫 岩, 赵淑华, 王丽丽, 王 欣， 孙德烨

(1. 长春大学 理学院, 长春 130022； 2. 吉林大学 材料科学与工程学院, 长春 130012；3. 吉林大学 公共卫生学院, 长春 130021)

石墨烯材料泛指石墨烯及其衍生物, 如氧化石墨烯(GO)与还原氧化石墨烯(rGO)等, 其具有较多的优异性能, 在能源储存、 生物医药及电子传感等领域应用广泛[1-3], 其中石墨烯材料的抗菌特性已引起人们广泛关注. Hu等[4]研究表明, 采用真空抽滤方法制备的纸状GO和rGO膜可通过破坏细菌细胞膜的方式消除大肠杆菌, 具有优异的抗菌活性. 采用真空抽滤方法制备石墨烯基膜材料, 可通过改变GO胶体用量实现对膜厚度的调控, 但基底应采用特殊的滤纸材料. 研究表明, 石墨烯基涂层可作为一种新型材料应用于组织工程领域[5].

在氧化石墨烯片层上有丰富的含氧官能团, 并具有石墨烯的层状结构, 其中羰基和羧基主要位于GO边缘, 环氧基和羟基主要分布在GO片表面[6-7]. 由于GO具有较高的比表面积, 同时在片层边缘和表面有丰富的含氧官能团, 因此可作为模块, 通过层层自组装方式形成石墨烯基膜, 其良好的生物相容性可有效担载第二相, 易形成多元复合材料, 充分发挥各组元的协同作用. GO与银纳米粒子(AgNPs)复合, 可减少金属银的用量, 降低AgNPs在生物体内产生的毒副作用, 并可抑制银纳米粒子发生团聚和氧化现象, 从而增强AgNPs的抗菌活性. He等[8]用液-液两相法将AgNPs复合在石墨烯纳米片表面, 获得了银-石墨烯杂化体系, 该复合物在有机相中具有稳定的分散性； 在复合过程中, AgNPs对石墨烯片层分散具有促进作用[9]； Cai等[10]研究表明, 纳米银/氧化石墨烯复合材料可降低AgNPs的释放速率, 从而使银/石墨烯复合材料的毒性较低, 且可在较长时间内保持优异的杀菌特性; Faria等[11]以GO为载体, 柠檬酸钠为还原剂, 用原位还原方法还原AgNO3制备的银/石墨烯复合材料, 抗菌测试表明, 该材料对大肠杆菌具有较高的抗菌活性； Fan等[12]通过加入交联剂与葡萄糖还原方法, 合成了银/石墨烯复合凝胶, 其作为伤口敷料具有较高的杀菌率, 并有助于伤口愈合. 基于细菌细胞内外的复杂机制[13], 石墨烯负载银纳米粒子复合材料通过破坏细菌的外层结构(如细胞膜和细胞壁)进入细胞, 影响细胞的新陈代谢和细胞繁殖, 从而杀死或抑制细菌繁殖和生长, 当细菌细胞失活后, 银离子可从细菌中释放, 继续杀灭其他细菌的活性, 从而具有相对持久的抗菌作用.

目前, 制备银/石墨烯复合材料的方法较多, 包括电化学沉积法[14]、 化学还原法[15]、 水热法[16-19]和自组装法[20]等, 在制备石墨烯基复合涂层过程中, 使用较多有毒的还原剂或在强碱条件下合成材料[21]. 用绿色化学方法合成复合抗菌材料或用天然物质替代化学还原剂, 将有助于生物相容性材料的开发和生物应用[22]. 本文在不添加分散剂、 黏结剂和有毒还原剂的条件下, 制备石墨烯基涂层, 并复合银纳米粒子, 制备具有抑菌和杀菌作用的石墨烯基抗菌复合膜. 该银/石墨烯复合抗菌膜制备简单易控、 成本较低, 有利于工业化生产. 根据需要可设计不同厚度、 形状和尺寸的复合膜, 这些复合膜在生物医药、 能源及航天航空等领域均具有广阔的应用前景.

1 实 验

1.1 材 料

石墨粉(质量分数为99.999 5%, 上海Afla Aesar有限责任公司), AgNO3(质量分数为88.8%)、 NH3(分析纯)、 H3PO4(优级纯)和C6H12O6·H2O(分析纯)均购于北京国药集团, 浓H2SO4(分析纯)、 浓HNO3(分析纯)、 浓HCI(分析纯)、 NaOH(分析纯)、 C2H6O(分析纯)、 H2O2(体积分数为30%)、 CH3COCH3(分析纯)和KMnO4(分析纯)均购于北京化工厂.

1.2 仪 器

BS423S型电子天平(北京赛多利斯仪器有限公司); HC-3514型高速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司); DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器(河南予华仪器有限公司); 080ST型超声波清洗机(深圳市华策科技有限公司); BPZ-6123型真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司); D8 Tools X型X射线衍射仪(德国Bruker公司); JSM-6335F型场发射扫描电子显微镜(日本电子公司); TECNAI G2 F20型透射电子显微镜(美国FEI公司); Frontier变换红外线光谱仪(美国PerkinElmer公司); JJC-I型润湿角测量仪(长春光学仪器厂).

1.3 氧化石墨烯的制备

先将360 mL浓H2SO4和40 mL浓H3PO4依次倒入锥形瓶内, 再加入3 g石墨粉, 充分搅拌后, 缓慢加入18 g KMnO4. 于50 ℃水浴中加热12 h, 并快速搅拌, 随水浴锅冷却至室温后, 先将锥形瓶内的溶液混合400 mL冰水, 再逐滴加入H2O2至无气泡产生. 将产物高速离心, 去除上清液, 先用稀HCl(质量分数为10%)离心酸洗3次沉淀物, 再用去离子水洗至中性, 得到一定质量浓度的氧化石墨烯胶体, 待用. 在700 W的条件下, 将超纯水稀释配制的25 mL(2 mg/mL)氧化石墨烯胶体超声搅拌30 min, 得到氧化石墨烯分散液.

1.4 银/石墨烯复合抗菌膜的制备

称取一定质量的AgNO3粉末溶解于去离子水中, 将纯氨水稀释质量分数为2%后, 缓慢滴加到AgNO3溶液中, 至溶液变无色, 得到银氨溶液. 将银氨溶液加入氧化石墨烯溶液中, 于60 ℃搅拌均匀后, 加入还原剂葡萄糖溶液, 常温静置90 min, 得到原位还原的Ag纳米粒子. 按V(H2SO4)∶V(H3PO4)=4配制食人鱼洗液, 将基底材料亲水化处理后, 用去离子水反复冲洗. 将Ag/GO混合分散液滴涂到基底上, 真空干燥, 得到Ag/GO复合膜. 用等面积的载玻片覆盖在干燥后的Ag/GO膜上, 真空下经100 ℃低温退火处理, 得到基于还原氧化石墨烯(rGO)的复合膜Ag/rGO.

1.5 表征与性能测试

用X射线衍射(XRD)测定膜样品的相结构, 测试采用Cu靶,λ=0.154 nm, 扫速为2°/min, 扫描范围为10°～80°； 用场发射扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)观察样品的微观形貌； 用Fourier变换红外线光谱仪(FTIR)分析样品的分子结构及相应的官能团, 扫描分辨率为1 cm-1, 光谱范围为500～4 000 cm-1； 用润湿角测量仪测试膜样品的表面亲/疏水性, 滴液高度为3 mm, 液滴体积为3～5 μL, 直径为1～2 mm； 用抑菌环法评估膜样品的抗菌性能. 先将银/石墨烯复合抗菌膜制成直径为6 mm的圆片, 再置于菌液浓度为106～107cfu/mL(cfu定义为单位体积内的细菌群落总数)的营养琼脂培养基平板表面上, 恒温37 ℃培养12 h, 观察并测量抑菌环直径. 实验重复3次以检测样品的抗菌性能.

2 结果与讨论

2.1 涂层的形貌

图1 Ag/GO膜(A)和Ag/rGO膜(B)的光学照片

复合膜的光学照片如图1的示. 由图1可见, 石墨烯基复合膜与玻璃基底紧密结合, 其附着性和铺展性优异, 未见气泡和针孔, 成膜状态良好, 有利于抗菌涂层的涂覆与应用. Ag/GO膜的外观为均一的棕黄色, 低温退火后的复合膜呈黑色, 这是由于氧化时增加了石墨烯的层间距, 使氧化石墨烯颜色变浅所致.

Ag/rGO膜的形貌如图2所示. 图2(A)为rGO膜表面的SEM照片, 由图2(A)可见, 石墨烯膜表面为典型的褶皱状, 成膜显示其连续性较好. 图2(B)为Ag/rGO膜表面的SEM照片, 由图2(B)可见, Ag纳米粒子呈球状, 均匀分散于石墨烯片层之间. 图2 (C)和(D)为Ag/rGO膜表面的TEM照片, 可进一步观测到GO片层上Ag纳米粒子的性状、 尺寸及分布. 统计结果表明, 纳米粒子大小较均一, 粒径约为20～50 nm, 未出现明显的团聚现象, 纳米颗粒在石墨烯膜褶皱处附着较多. 这是由于还原石墨烯褶皱处官能团数量较多, 可为复合Ag纳米粒子提供更多的有效结合位点所致.

图2 Ag/rGO膜的形貌

GO膜、 rGO膜、 Ag/GO膜和Ag/rGO膜的接触角如图3所示. 由图3可见: 其接触角分别为63.2°,93.7°,53.4°,85.6°; GO膜经部分还原后所得rGO膜的接触角从63.2°增加到93.7°, 这是由于还原后的GO膜表面含氧官能团减少, 使膜的亲水性下降所致; 加入Ag纳米粒子, GO和rGO膜的接触角减小, 润湿性增强, 分别高于其相应的纯相材料. 润湿性增强有利于提高细菌和菌落与复合材料接触时的附着性, 从而增强了复合材料的抗菌性能.

图3 GO膜(A)、 rGO膜(B)、 Ag/GO膜(C)和Ag/rGO膜(D)的接触角

2.2 涂层的结构

Ag/GO和Ag/rGO膜的XRD谱如图4所示. 由图4可见, Ag的面心立方特征峰位于(111),(200),(220),(311)处, 表明Ag纳米粒子已与氧化石墨烯和还原石墨烯纳米片复合. 该合成方法可降低单独用Ag纳米粒子对人体的毒副作用, 且有助于提高Ag纳米粒子的分散性及利用Ag纳米粒子作为高效抗菌剂制备抗菌膜的优点. Ag/GO膜在10.1°处出现GO的特征峰, 其边缘携带的大量含氧官能团增加了片层间距, 可有效提高Ag纳米粒子的分散性. 退火处理后的GO(002)峰强明显下降, 但Ag粒子XRD的峰形、 峰强和峰位均无明显变化, 表明低温加热还原处理未明显改变Ag粒子的大小和含量.

图4 Ag/GO和Ag/rGO膜样品的XRD谱

图5 Ag/GO和Ag/rGO膜的FTIR谱

2.3 涂层的抗菌活性

用金黄色葡萄球菌(S.aureus)和大肠杆菌(E.coli)评估GO,rGO,Ag/GO和Ag/rGO膜抗菌活性的光学照片如图6所示, 其中培养基上的颗粒即为细菌菌落, 膜片周围的无菌生长圆环即为抑菌环, 抑菌环的大小可定性反映复合材料的抗菌效果.

图6 GO,rGO,Ag/GO和Ag/rGO膜对金黄色葡萄球菌(S.aureus)及大肠杆菌(E.coli)的抗菌活性光学照片

由图6可见： 在GO和rGO膜上均未出现抑菌环, 但样品表面没有细菌繁殖； Ag/GO膜上出现明显的抑菌环, 低温退火处理后的抑菌环增大, 分别由12.5 mm增加到15.3 mm(大肠杆菌)以及从12 mm增加到14 mm(金黄色葡萄球菌), 表明其抗菌活性增强. Ag/GO膜对金黄色葡萄球菌比大肠杆菌的抗菌活性差, 该结果与文献[25]的结果一致. 这是由于Ag纳米粒子的抗菌机制及阴性菌与阳性菌细胞膜差异有关, Ag纳米粒子对阴性菌的抗菌效果更明显, 抗菌活性与Ag纳米粒子的粒径、 剂量/浓度和形状等因素有关[26]. Morones等[27]研究了不同粒径的Ag纳米粒子的抗菌活性, 结果表明, Ag纳米粒子粒径越小抗菌性能越强. 这是由于粒径小的Ag纳米粒子具有更大的比表面积, 容易释放更多具有杀菌性能的Ag+, 并可产生较多的活性氧自由基, 导致氧化应激反应加快细菌死亡. 此外, 粒径小的Ag纳米粒子更易进入细菌的细胞质, 降解破坏细菌的DNA, 从而杀死细菌[28]. Tang等[29]研究表明, 当氧化石墨烯与Ag纳米粒子质量比为1时, 复合材料的抗菌活性最强.

综上, 本文用SEM,TEM,XRD,FTIR和润湿角测量等方法对石墨烯基复合膜材料进行了表征. 测试结果表明： 制备的复合膜在滴膜干燥过程中可较好地平铺于基底表面, 成膜质量良好； Ag/GO和Ag/rGO膜对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有较好的抗菌活性； 退火处理有助于提高Ag/GO复合膜的抗菌性能.