结肠腺癌中Dyrk1B的表达及对临床预后判断的价值

蒋淳琪 张磊

结肠腺癌是由结肠黏膜上皮异型增生形成的肿瘤，临床较为常见，主要发生于中老年人，与病变相关分子生物学机制较多，其涉及遗传学和增殖基因调控的领域［1］。双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1B（dual specificity tyrosinephosphorylation regulated kinase 1B，Dyrk1B）是一种丝氨酸或酪氨酸蛋白激酶，位于19号染色体上，在脑组织或肌肉组织中表达，其它正常组织中表达较少［2］，近年研究显示Dyrk1B在幼稚的细胞中表达升高，其可能与肿瘤的形成有关［3］。Dyrk1B在结肠腺癌中的表达未见相关报告，对预后的判断价值尚无研究。本实验应用免疫组化、Western Blot和荧光实时定量PCR法检测结肠腺癌中Dyrk1B的表达，探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般材料 选择2012年1月至2014年12月在宁波市中医院确诊为结肠腺癌，并行手术治疗的患者作为研究对象。共观察87例，其中男47例，女40例；年龄40～87岁，平均62.3岁，中位年龄59岁。均留取肿瘤组织的新鲜组织和石蜡包埋组织作为观察组，留取距肿物边缘＞3cm的正常结肠黏膜的新鲜组织和石蜡包埋组织作为对照组。新鲜组织应用-80℃冰箱冻存备用。本研究由医院伦理委员会批准，并经家属签订知情同意书。纳入标准：（1）由病理医师复诊切片，并按WHO的标准分型者。（2）原发肿瘤者。排除标准：（1）手术前接受放、化疗者。（2）林奇综合征者；（3）消化系统发育畸形者；（4）伴有其它器官恶性肿瘤者。

1.2 Dyrk1B表达的检测及结果判定 （1）免疫组化法：术后标本常规取材，应用福尔马林固定，脱水机脱水，并行石蜡包埋，切4μm切片后置于胶片上，应用免疫组化二步法检测Dyrk1B的表达。Dyrk1B浓缩液购自ABGENT公司，二抗和DAB购自福州迈新公司。先进行预实验，选择1：200显色最理想的浓度用于正式实验。操作由同一检验师操作完成，做好质控工作，减少人为误差。Dyrk1B的显色部位是细胞浆，以棕黄色为阳性细胞。由两位病理医师应用盲法进行判读，选择上皮细胞分布集中的热点区进行观察，共选择5个400倍视野，以阳性率＜10%为阴性，以＞10%为阳性计算阳性率。（2）Western Blot法检测：取新鲜冻存标本，适当的裂解液处理组织样品，测定每个蛋白样品的蛋白浓度。在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。100℃或沸水浴加热3～5min，以充分变性蛋白。冷却至室温后，将蛋白样品直接上样至SDS-PAGE胶加样孔内。转膜完毕后，立即将蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗1～2min，以洗掉膜上的转膜液。吸尽洗涤液，加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动，室温封闭60min。对于一些背景较高的抗体，4℃封闭过夜。吸尽封闭液，加入稀释好的一抗，室温摇床上孵育1h或者4℃孵育过夜。吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或者4℃摇床上孵育1h。ECL化学发光，显影，定影。将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图像处理系统分析目的条带和内参条带的净光密度值以及他们的比值。应用新鲜冻存组织。内参应用GAPDH。取新鲜组织，提取总蛋白，测定试剂盒定量，丙烯酰胺凝胶电泳，经湿转法转至PVDF膜，牛奶封闭后稀释好抗体，4℃置于冰箱中过夜，取出后进行洗涤，加入二抗，孵育2h，化学发光剂显影，并拍照，用凝胶分析软件对图像进行分析。灰度分析应用Image J V1.47H软件，以蛋白与GAPDH的比值进行分析其相对表达量。（3）荧光PCR法检测：检测新鲜标本中Dyrk1B的mRNA的表达。记录Ct值，通过2-ΔΔCt法计算目的基因和相对表达水平。ΔΔCt=［Ct目的基因（未知样品）-CtGAPDH（未知样品）］-［Ct目的基因（校正样品）-CtGAPDH（校正样品）］。操作严格按实验步骤完成，均由同一实验师完成，做好质控工作。

1.3 统计学方法 采用SAS6.12分析。计量资料以（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以n或%表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化结果 （1）两组中Dyrk1B阳性率的比较：观察组中Dyrk1B的阳性率均明显高于对照组（见表1）。（2）观察组不同特征分组中Dyrk1B阳性率比较：观察组中Dyrk1B的表达与肿瘤最大径、淋巴结转移、增殖指数、脉管累犯、神经累犯和TNM分期密切相关，Dyrk1B的表达与性别、年龄、部位、分化程度和炎细胞浸润程度无明显相关性（见表2）。（3）观察组中Dyrk1B表达的生存分析：术后随访患者时间为6～60个月，应用生存分析显示观察组中Dyrk1B与生存时间有关，即Dyrk1B高表达患者的生存时间短，预后差（见图1）。

表1 两组中Dyrk1B阳性率的比较［n（%）］

表2 观察组不同特征分组中Dyrk1B阳性率比较［n（%）］

图1 结肠腺癌中Dyrk1B与生存时间的关系

2.2 两组中Western Blot法检测Dyrk1B蛋白半定量表达的比较 观察组中Dyrk1B的半定量表达量为（0.98±0.20），对照组中Dyrk1B的半定量表达量为（0.68±0.21），两组比较差异有统计学意义（P=0.010）。（见图2）。

2.3 两组荧光实时定量PCR法检测Dyrk1B mRNA的比较 观察组中Dyrk1B mRNA表达的阳性率为（1.12±0.24）%，对照组中Dyrk1B mRNA表达的阳性率为（0.80±0.26）%，两组比较差异有统计学意义（P=0.021）。

图2 Western Blot法检测观察组和对照组中Dyrk1B的表达

3 讨论

结肠癌的形成与细胞的异型增殖有关，Dyrk1B又称为Mirk，其基因位于19号染色体q12-13.11上，由11个外显子和10个内含子组成，其具有三种剪接变形体，即P65、P69和P75。由于P65在体外缺乏激酶活性并不含有酪氨酸磷酸化功能，因此其激酶的不同功能与剪接差异有关［4］。有研究将Dyrk1B基因敲除后发现可以改变调控肿瘤细胞增殖分化的相关蛋白，如PRAP、bcl-2等，进而抑制肿瘤细胞增殖和分化［5］。Dyrk1B敲除后不引起胚胎致死，有观点认为Dyrk1B与正常细胞的形成无必然联系，Dyrk1B可能是肿瘤治疗的靶点［6］。缺氧和低pH值等因素能诱导肿瘤细胞异常表达Dyrk1B，使细胞进入暂时性休眠状态的G0期，并在E2F4复合物的作用下稳定停留在 G0期，该阶段可促进肿瘤细胞完成ROS损伤的修复过程，并减少毒性ROS自由基的产生［7］。血清“饥饿”诱导结肠癌细胞进入G0期，肿瘤细胞内的Dyrk1B敲除后逃离G0期的肿瘤细胞迅速增加［8］。Dyrk1B通过磷酸化阻止细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）抑制子P27的降解使细胞处于G0期。Dyrk1B无论扩增与否，均可通过磷酸化降低cyclinD1与cyclinD3的稳定性，使细胞处于高度活跃状态。Dyrk1B对组织发育和染色质重塑的作用更明显，Dyrk1B的作用方式可能更多［9］。Dyrk1B可能下调Spry2和ERK MAPK途径发挥促进肿瘤增殖、迁移的作用［10］。ERK下调后可以激活MMPs的调节，能促进细胞外基质的降解，加速肿瘤细胞的迁移。Dyrk1B在肿瘤迁移过程中可能对上皮间质转化有一定的促进作用［11］。

本实验结果显示，结直肠腺癌中Dyrk1B的表达明显高于对照组，提示Dyrk1B是肿瘤形成的促进蛋白，其作用与促进肿瘤细胞增殖有关，Dyrk1B通过P27调控CyclinD1的结合，进而调控细胞G0静止期通过检测控制进入S期。Dyrk1B的肿瘤细胞特异性，可作为肿瘤细胞治疗靶点开发抗癌药物，同时，其下游调控的细胞周期蛋白Cdk4抑制剂已成为抗癌药物，二者协同作用可增强肿瘤治疗特性。观察组中Dyrk1B的表达与肿瘤最大径和增殖指数相关，提示Dyrk1B高表达是促进肿瘤细胞失控性增殖的重要蛋白因素，Dyrk1B对细胞的增殖作用使细胞的增生活跃，细胞的数量增多，异型细胞增加，肿瘤体积增大，细胞侵袭生长的能力增强。结果显示Dyrk1B的表达与淋巴结转移、脉管累犯和神经累犯相关，提示Dyrk1B直接参与肿瘤的进展及肿瘤细胞的播散。Dyrk1B高表达引起细胞的迁移作用也提示可能是转移相关基因的作用。Dyrk1B可以引起细胞增生，增生的细胞幼稚，体积小，迁移能力强，是转移的重要肿瘤细胞，且细胞迁移后，幼稚的细胞适应异源性组织的能力强，定植程度高，肿瘤细胞在非原发灶的部位生长繁殖。结果显示Dyrk1B的表达与TNM分期相关，提示可能是判断肿瘤分期的辅助指标。本研究未发现Dyrk1B的表达与分化程度和炎细胞浸润程度的相关性，提示Dyrk1B与幼稚细胞的异型增生和炎性周围环境无明显关联性。结果显示Dyrk1B的表达与生存时间有关，提示Dyrk1B对判断预后可能有一定帮助，因此临床可以检测Dyrk1B的表达辅助判断预后，即高表达患者的预后较差，但其临界值尚需要多中心、大样本的数据进行初步敲定。本实验免疫组化的结果经Western Blot的半定检测得到验证，同时显示出Dyrk1B蛋白与mRNA表达具有一致性。Dyrk1B具有癌基因样的作用，引起肿瘤异型增生明显，细胞分裂速度增加。Dyrk1B参与肿瘤的形成是其经典作用，Dyrk1B参与肿瘤进展可能是通过对相关因子表达的调节实现的。Dyrk1B表达调控主要发生在基因转录水平。也有学者认为Dyrk1B可以引起上皮粘附素的低表达，使恶性肿瘤细胞间的连接松动，同时引起神经型粘附素的高表达，引起转移灶细胞的异质型粘附作用增加，肿瘤定植能力提高，形成转移灶［12］。肿瘤形成中具有一定的间质反应，主要表现为纤维化和炎细胞浸润，这与Dyrk1B的表达升高直接相关，是肿瘤直接侵袭或种植的结果，常伴随着明显的炎症反应，此种作用是持续性的。使Dyrk1B下调可以抑制肿瘤细胞的增殖作用，其作用可能是通过下调CyclinD1、P21实现的。

总之，Dyrk1B蛋白和mRNA在结肠腺癌组织中表达升高，是肿瘤形成和进展中重要的促进因素，检测术后组织中Dyrk1B的表达对判断预后有一定价值。