miR⁃214抑制牙囊细胞成骨分化的体外研究

王智亨，左婕，王梦琪，朱少军，刘奕杉

新疆医科大学第一附属医院（附属口腔医院）儿童口腔科-口腔预防科，新疆维吾尔自治区口腔医学研究所，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐（830054）

1 材料和方法

1.1 主要试剂

α-MEM培养液、PBS缓冲液、胎牛血清及2.5 g/L胰蛋白酶、opti-MEM、双抗（Hyclone，美国）；谷氨酰胺和Ⅰ型胶原酶溶液（Gibco，美国）；β-甘油磷酸钠、地塞米松、抗坏血酸（Sigma，美国）；lipofectamine 3000（Invitrogen，美国）；miR-214-3p mimics（5′-ACAGCAGGCACAGACAGGCAG-3′，5′-GCCUGUCUGUGCCUGCUGUUU-3′）、miR-214-3p inhibitor（5′-CUGCCUGUCUGUGCCUGCUGU-3′）和染料法Hairpin-it miRNAs定量和U6校准qRT-PCR试剂盒（吉玛，上海）；荧光定量试剂盒、反转录试剂盒和RIPA裂解液、ECl显色液、AP显色液（Thermo，德国）；RUNX-2抗体、β-actin抗体、β-catenin抗体、山羊抗兔荧光二抗（Abcam，美国）、兔抗鼠荧光二抗（中杉金桥，中国），茜素红（北京索莱宝科技有限公司）。

1.2 牙囊细胞的分离与培养

取3～4日龄SD大鼠的乳鼠（动物合格证号：SCXK（新）2013-0002，新疆医科大学动物实验中心）脱颈处死，75%酒精浸泡5 min，取双侧下颌骨，PBS冲洗，洗净血液，剥除颌骨多余肌肉组织，置于装有α-MEM的培养皿中，显微手术器械剥离牙胚，体视显微镜下剥离牙胚表面牙囊，剪碎，吸取置15 mL离心管中，以1 000 r/min离心5 min，弃去上清，置2 mL胰酶于离心管中重悬组织碎片。将离心管至于37℃水浴锅中震荡5 min，加入4 mLⅠ型胶原酶。将离心管至于37℃摇床中，200 r/min消化35min。置4 mL完全培养基终止消化，以1 000 r/min离心5 min，弃去上清。以10 mL完全培养基（含有15%FBS、1%双抗及1%谷氨酰胺，以α-MEM配制）重悬离心管底部细胞团块，至于培养瓶中放入37℃，含有饱和湿度及体积分数5%二氧化碳的细胞培养箱中，12～15 h换液，双向差速传代法纯化牙囊细胞，此前本课题组已进行鉴定［10］，传代至第3～4代备用。

1.3 转染与成骨诱导

转染前一天取3～4代牙囊细胞接种于6孔板中，确保细胞处于对数生长期，24 h内可生长至70%，弃去原培养基，PBS冲洗3次，每孔加入完全培养基1.5 mL待用。每孔取250μL Opti-MEM与4μL Lipofectamin 3000混合5 min，250μL Opti-MEM与5μL miR-214 mimics（miR-214 mimics组），miR-214 inhibitor（miR-214 inhibitor组），混合5 min，将两种混合液混合20 min，滴入孔板，轻晃混匀。5 h后更换成骨诱导液培养（质量分数为10%FBS、0.1μmol/L地塞米松、10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠和50 mg/L维生素C的α-MEM培养液），每2日换液。

1.4 RNA提取及qRT-PCR

1.4.1 转染效率及成骨诱导后miR-214的表达 转染1、2、3 d后，提取miR-214 mimics组、miR-214 inhibitor组和DFCs组（正常DFCs）细胞，利用Trizol提取总RNA，qRT-PCR检测miR-214。以上3组成骨诱导7 d，利用Trizol提取总RNA，进行qRTPCR。逆转录条件：采用20μL体系，温度设置为25℃30 min，42℃30 min，85℃5 min，4℃保存。PCR反应条件为：20μL体系，温度设置为：预变性95℃3 min，PCR反应95℃12 s，62℃40 s，40个循环。引物见表1。

1.4.2 成骨相关基因的检测 上述3组经成骨诱导7 d的细胞，利用Trizol提取总RNA，使用反转录试剂盒将所提取RNA反转录为cDNA，再使用Syber Green检测试剂盒将所得的cDNA进行扩增，qRTPCR进行成骨相关基因：成骨相关转录因子2（runtrelated transcription factor-2，RUNX-2）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨粘连蛋白（osteonectin，OSN）的检测。均采用20μL体系，引物见表1。反应条件为：PCR反应条件：95℃预变性2 min，95℃5 s；60℃10 s，45个循环。

表1 qRT-PCR目的基因引物序列Table 1 qRT-PCR target gene primer sequence

1.5 蛋白免疫印迹

上述3组成骨诱导7 d，培养皿使用PBS冲洗3次后，加入细胞裂解液，置于冰上30 min；用细胞刮刀仔细刮擦六孔板底，将刮取的细胞碎片吸入预冷的微量离心管中，超声裂解细胞；将获得的细胞裂解液离心5 min（4℃120 000 r/min），取上清用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，加入蛋白上样缓冲液后，100℃煮沸蛋白5 min使其变性，冰上冷却，短暂离心后备用。制胶，电泳后80 mA转膜条件2 h，封闭2 h后，以脱脂牛奶稀释RUNX-2、βcatenin、β-actin一抗4℃孵育过夜。TBST洗膜3次，每次10 min。二抗孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，β-catenin、β-actin使用ECL发光剂液显色，RUNX-2使用AP显色液显色蛋白凝胶成像系统分析样品中目标蛋白的相对含量。

1.6 茜素红染色

将miR-214 mimics组、miR-214 inhibitor组、DFCs组细胞接种于30 mm培养皿中，成骨诱导14 d，弃去培养液，使用PBS冲洗3次，用多聚甲醛固定细胞，茜素红染液染色5 min，ddH2O漂洗3次，倒置显微镜下观察。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 牙囊细胞的分离培养

原代细胞接种于培养瓶中10 d可生长至80%～90%，经双向差速法提纯3～4代可得纯化的牙囊细胞（图1）。

Figure 1 Primary DFCs and DFCs purified to the third generation by bidirectional differential passaging图1 原代DFCs及经双向差速传代法提纯至第三代的DFCs

2.2 qRT-PCR

2.2.1 转染效果 经qRT-PCR检测，转染1 d，miR-214 inhibitor组miR-214表达受抑制，较正常DFCs下降43倍（P＜0.01），miR-214 mimics组表达上调41倍（P＜0.01）；转染2 d及转染3 d，miR-214的转染效果逐渐弱化（P＜0.05）（图2）。

Figure 2 Expression of miR-214 1,2 and 3 days after transfection of the miR-214 mimics and miR-214 inhibitor图2 转染miR-214 mimics及miR-214 inhibitor后1、2、3 d miR-214表达情况

2.2.2 成骨诱导后miR-214的表达 成骨诱导7 d，miR-214 mimics组miR-214的表达较正常DFCs组高22倍（P＜0.01），而miR-214 inhibitor组miR-214的表达低于正常DFCs组，差异具有统计学意义（P＜0.05）（图3）。

2.2.3 成骨诱导后成骨相关基因的表达 miR-214 mimics组，成骨相关基因ALP、OSN及RUNX-2的mRNA表达均低于正常DFCs组，但仅ALP在两组的差异具有统计学意义（P＞0.05），而miR-214 inhibitor组成骨相关基因OSN及RUNX-2、ALP的mRNA表达均高于DFCs组，且差异具有统计学意义（P＜0.05）（图4）。

Figure 3 Expression of miR-214 after 7 days of osteogenesis induction after the transfection of the miR-214 mimics and miR-214 inhibitor图3 转染miR-214 mimics及miR-214 inhibitor并成骨诱导7 d miR-214的表达情况

Figure 4 Expression of ALP,OSN,RUNX-2 after 7 days of osteogenesis induction after the transfection of the miR-214 mimics and miR-214 inhibitor图4 转染miR-214 mimics及miR-214 inhibitor并成骨诱导7 d ALP、OSN、RUNX-2 mRNA表达情况

2.3 免疫蛋白印迹结果

miR-214 mimics组，RUNX-2、β-catenin的蛋白表达均低于miR-214 inhibitor组，但miR-214 mimics组及miR-214 inhibitor组RUNX-2、β-catenin的蛋白表达均高DFCs组（图5）。

Figure 5 Expression of RUNX-2 andβ-catenin after 7 days of osteogenesis induction in the miR-214 mimics,miR-214 inhibitor，DFCs groups图5 miR-214 mimics组、miR-214 inhibitor组、DFCs组成骨诱导7 d RUNX-2、β-catenin蛋白的表达情况

2.4 茜素红染色结果

成骨诱导14 d，经茜素红染色可明显观察到，miR-214 mimics组钙化结节明显少于DFCs组，而miR-214 inhibitor组的钙化结节却明显多于DFCs组（图6）。

Figure 6 Images of mineralized nodules by alizarin red staining after 14 days of osteogenesis induction in the 3 groups图6 成骨诱导14 d 3组矿化结节茜素红染色图片

3讨论

牙囊在牙齿萌出过程中的作用是不可替代的，在形成牙齿萌出通道，提供牙齿萌出的动力中发挥了不可替代的作用，具体表现为牙囊方的破骨现象以及根方的成骨现象［11-12］。经典的Wnt通路对成骨分化的调控取决于细胞的类型，以及成骨分化的阶段［13-14］，在本研究中发现了Wnt/βcatenin经典通路对于牙囊细胞的成骨分化早期的促进作用，而不是抑制。

Wang等［15］通过切除大鼠卵巢建立骨质疏松模型，发现其骨组织miR-214高表达，在后肢卸载小鼠卸载模型中，其成骨细胞中miR-214水平较基线小鼠更高。在体内注射antagomir-214（miR-214拮抗剂）后，发现可以逆转上述现象。其体外细胞实验也得出了相同的结论。并发现miR-214与转录因子4（activating transcription factor 4，ATF4）呈负相关，并通过荧光素酶报告法证明了ATF4是miR-214的靶基因。类似的结果在Yao等［16］的研究中也得以证明，其利用牙周膜干细胞的干细胞特性进行成骨诱导，发现miR-214的表达在成骨诱导后下调，而ATF4的表达下调。将miR-214 inhibitor（miR-214抑制剂）转染至牙周膜干细胞后行成骨诱导发现细胞的成骨基因表达上调，而ATF4表达上调，这与本研究的结果一致。同样，动物实验也有力的证明了这一点，有研究建立小鼠的胫骨骨折模型并定期注射agomir-214及antagomir-214，发现agomir-214组中小鼠骨折愈合状况差于antagomir-214组，且Western-blot实验显示β-catenin的表达也受到抑制［17］。miR-214对于β-catenin的抑制作用还体现在其对于调节人毛囊干细胞的增殖与分化中［18］。除此之外，有研究还发现抑制miR-214可以促进小鼠成骨细胞MC3T3-E1的成活以及其细胞外基质的形成，而细胞外基质的形成是矿物质积累以及成骨现象的基础［19］。已有用于治疗骨质疏松的研究表明，通过纳米粒子向骨吸收表面传送anti-miR-214可以改善骨微结构和骨质量［20-21］。本研究证明了牙囊细胞在成骨诱导后其β-catenin表达上调，转染miR-214 mimics的牙囊细胞其成骨分化受到抑制，β-catenin的表达呈现抑制的现象，而转染miR-214 inhibitor的牙囊细胞与之相反。说明miR-214对于牙囊细胞的成骨分化起这抑制的作用，其中有可能是通过下调β-catenin的表达来实现的。本研究有一定的不足之处，未能进一步检测Wnt/β-catenin通路下游基因的表达，因此未能完全阐述miR-214抑制DFCs成骨分化的确切机制。

进一步明确miR-214对于牙囊的调控作用，将有助于预防及治疗牙齿萌出障碍，更好造福于患者。