非梗阻性无精子症患者X染色体连锁的TEX11基因多态性研究

罗招云 李绪杰 林芬 查广才 杨立业★

在全世界范围内，男性不育无精子症的发病率高达15%～20%，并呈现出快速增长的趋势[1]。男性不育症已成为一个严重的生殖健康问题[2]。大多数非阻塞性无精子症的遗传基础还未知[3]。遗传因素常被认为是无精子症中男性不育的主要原因[4]，X染色体连锁的TEX11基因在睾丸中表达，与精子发生功能有关[5]，TEX11的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）与特发性男性不育密切相关[6]。TEX11缺乏导致减数分裂停滞和雄性不育，对无精子症患者进行TEX11突变筛查是为了查明雄性不育潜在的因素[7]。本研究收集潮州地区35例男性非阻塞性无精子症患者血液标本，进行TEX11的SNP检测，探讨其与无精子症发生的关系，对它的发生率及其基因型别进行统计，评估TEX11的SNP与无精子症之间的相关性及其可能在中国非阻塞性无精子症患者发病中的作用。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 样本来源

选取2012年6月至2018年5月来我院泌尿外科和生殖医学科就诊的男性患者为实验对象，实验组纳入标准参照文献[8-9]对无精子症的诊断标准，即射出的精液离心后镜检未观察到精子，且通过3次和3次以上离心镜检，同时排除逆行射精和不射精等，即可诊断为无精子症。离心标准：取出1mL精液，以3000g（4096r/min）离心15min，余下约50μL精浆。以纳入标准收集到217例无精子症患者血液样本。排除标准为男性无输精管炎症、睾丸（附睾）炎症、精囊炎、输精管道缺如、输精管道阻塞、Y染色体微缺失。217例无精子症患者筛选出35例非梗阻性无精子症患者为实验对象，年龄20～43岁，平均年龄（30.11±5.13）岁，平均体重（58.37±2.43）kg。对35例血液标本进行X染色体上TEX11的SNP检测。

收集2018年2月至5月来本院体检中心体检的30例生精正常的男性血液标本作为对照组。年龄26～47岁，平均年龄（32.11±3.57）岁，平均体重（61.37±1.82）kg。经详询，30例男性均是在未采取避孕措施下1年内使妻子自然受孕。

1.1.2 仪器与试剂

XP基因扩增仪（型号：TC-XP-D，货号：BYQ602402Y-273）购自杭州博日科技有限公司；电泳仪：电泳槽（型号：DYCP-38B型，货号：No.0838B-191-06）和电泳仪电源（型号：DYY-6C型，出厂编号：15。新6C.1210-11），均购自北京六一生物科技有限公司；凝胶成像系统（Tanon Gellmage System，型号：Tanon-1600，货号：15T5561-313）购自中国上海天能科技有限公司。外周血全血DNA提取试剂盒（型号：全血DNA溶液型，批号：W201708002）购自深圳亚能生物技术有限公司，DNA maker（型号：M1091/M1092，批号：014）购自广州东盛生物科技有限公司，2×Tap PCR MasterMix（型号：PC0902，批号：282238AX）购自北京艾德莱生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 外周血DNA提取

外周血DNA的提取严格按照全血DNA提取试剂盒说明书操作，制备好的DNA样品置于-20℃保存备用。

1.2.2 引物设计和合成

利用Primer premier 3.0引物设计工具，将29个TEX11的基因序列编码外显子序列分段设计合成，其中3个基因序列引物自行设计，见表1；另26个基因序列引物参照参考文献[3]。引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

1.2.3 PCR扩增TEX11DNA

在XP基因扩增仪上经过PCR温度梯度实验，逐一确定29对引物扩增合适的退火温度，见表1，PCR扩增的体系参数和反应条件如下：PCR扩增的体系参数：Mix Taq，12.5μL；纯净水，8.5μL；上下游引物各1.0μL；总cDNA，2.0μL；体系总体积25.0μL。PCR反应参数设置：95℃预变性3min；94℃变性30s，退火30s（温度见表1），72℃延伸50s，循环35次；72℃延伸5～10min。在确定各对引物PCR扩增退火温度下，对35例非梗阻性无精子症患者的DNA标本进行外显子序列分段式扩增。

表1 TEX11基因的3个编码外显子DNA引物和PCR扩增退火温度Table1 The 3coding exon DNA primers of the TEX11 gene and PCR amplification annealing temperature

1.2.4 电泳

用1.5%琼脂糖凝胶，200V电压，140mA电流，电泳时间为25min，对PCR扩增产物进行电泳，电泳结束后将凝胶轻置于Tanon 1600凝胶成像系统中，观察DNA条带亮度、位置，拍照记录。

1.2.5 PCR产物测序

将合格的PCR扩增产物送至上海英骏生物技术公司（广州）进行测序。

1.2.6 基因序列比对

根据测序出来的结果，通过Chromas测序分析软件人工查看测序图确认检测结果是否成功，将测出的正反向基因序列通过pubmed的Nucleotide BLAST数据库进行比对，以确定非梗阻性无精子症患者X染色体上的TEX11基因是否发生突变，突变位点排除杂合子突变。

1.3 统计分析

应用SPSS 19.0软件进行统计学分析，用卡方检验对实验组和对照组的突变率进行统计，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基因测序结果分析

在35例实验组患者标本中检测到2种错义突变类型，分别是Exon7：c.389A＞G，突变率37.1%Exon 17：c.1351G＞A，突变率8.6%。2种错义突变引起的编码氨基酸变化分别是：c.Lys 130Arg和c.Gl u451Ly s；在对照组中发现Exon7、Exon 17也有相同位点突变，突变率分别为：37.5%、8.3%此外，在实验组中发现2处同义突变，分别是Exon 27：c.2319 T＞A，突变率为71.4%；Exon 29 c.2541T＞C，突变率为20.0%。在实验组和对照组中都发现了TEX11的2个外显子相同位点的突变（Exon 7：c.389 A＞G，Exon 17：c.1351G＞A），见表2和图1。；。：

表2 非梗阻性无精子症患者和对照组TEX11基因外显子编码基因序列突变[n（%）]Table2 TEX11 genemutation of the exon encoding sequence inmales with non-obstructive azoospermia and the controlgroup[n（%）]

图1 非梗阻性无精子症患者TEX11基因的2处错义突变Figure1 2missensemutations in the TEX11 gene of non-obstructive azoospermia

3 讨论

在成人男性中，高达1%的人群患有无精子症[10]，男性不育患者中有近25%是非梗阻性无精子症导致的[11]。非梗阻性无精子症是一种多因素疾病，其分子基础仍然大部分未知，几乎一半的男性不育症与遗传缺陷有关[3]。目前，国内外对男性非梗阻性无精子症的TEX11基因突变研究报告极少。关于X染色体上的生精基因研究会逐渐成为国际上的研究热点，包括TEX11基因在内的基因已被报道为无精子症的可能关联因素[12-13]。TEX11基因表达蛋白是一种X染色体编码的生殖细胞特异性蛋白质，在睾丸中的精原细胞和早期精母细胞中表达量最大[14]。TEX11基因在精子发生早期扮演一个重要角色[15]。TEX11基因是减数分裂的一个明确因素[16]。TEX11基因突变导致减数分裂停滞，是精子形成失败导致非梗阻性无精子症的原因，TEX11基因对精子发生障碍有重要意义[3-4]。

目前，由基因异常导致的男性不育主要是：性染色体与生精基因的缺失与突变、常染色体基因的缺失与突变[17]。不少学者研究不育男性X连锁的TEX11基因突变[3-4]。目前，共发现TEX11基因有46个不同突变[3-4]。TEX11基因突变发生率在德国是2.4%（7/289），在美国无精子症患者中的发生率是14.5%（35/246）[3-4]，本研究TEX11基因突变发生率是37.1%（13/35）。TEX11基因突变发生率差异可能与种族特点不同有关[7]。在一项试验中，敲除老鼠TEX11基因上共30个外显子中的27个，染色体在粗线期不结合使精子发生受损，导致细胞死亡和雄性不育[16]。Yatsenko等[3]通过研究发现6个不同TEX11基因突变，包括外显子9～11缺失（607del1237bp），3个剪切突变（c.405C＞T，748+1G＞A，1793+1G＞C），2个错义突变（c.466A＞G，2047G＞A）。Yang等[4]发现40个不同TEX11突变，18个在无精子症患者中检测出，包括5个外显子错义突变（W117R，V142I，Q172R，T244I，V748A），2个外显子无义突变（405C＞T，2319T＞C），1个外显子移码突变，10个内含子突变；另22个在正常生育男性中发现，其中4个外显子错义突变（K115R，M152V，E436K，D832E）。日本研究者[10]对包括TEX11基因在内的25个相关基因进行突变筛选，发现1个TEX11突变（c.A511G，Met171Val）。在中国人群中，仅有1篇文献报道1对不育兄弟在TEX11基因的29号外显子上发现2653G＞T[7]。本研究的TEX11基因30个外显子发现4个SNP，2个外显子错义突变（Exon 7：c.389 A＞G；Exon 17：c.1351G＞A）和2种无义突变，与上述研究者发现的基因突变位点均不相同，与欧美基因突变位点不同的原因可能是人种不同；与日本研究者的不同，可能与本实验样本例数太少有关。本研究实验组和对照组中都有相同位点2个错义突变，推测这2种突变不影响TEX11基因的功能，与Ya n g等[4]研究的结论基本一致。在正常生育男性中发现TEX11基因突变，以及大部分TEX11基因突变准确原因还不明确，可能提示这些突变与无精子生成不相关[4]。这么丰富的TEX11突变增加了诊断导致雄性不育的困难[7]。Zhang等[6]研究阐述了TEX11基因的SNP与无精子症具有相关性；TEX 11基因突变在男性不育中，特别是与无精子症有密切相关[7]。

综上所述，TEX11基因的SNP在非梗阻性无精子症的临床意义目前是不明确的，与Mitchell等人[18]的研究结论是一致的，TEX11基因功能目前与男性不育的关系还无定论，本研究结果的结论也是如此。鉴于本研究样本例数少，生育男性也发现TEX11基因突变，因此在潮州地区人群中TEX11基因与男性不育的关系还有待更进一步深入研究。在检测TEX11基因突变时，结合睾丸组织学活检和不育史家系调查，更有助于得出TEX11基因突变与男性不育的相关性[7]。