血浆脂蛋白亚组分检测方法的研究进展与评价

朱心雨，明心亮，冯艳林，贺丁冬，涂建成(武汉大学中南医院检验科基因诊断中心，武汉 430071)

血浆脂蛋白是在体内输送或摄取特定脂质的异质性血液颗粒，因此其在脂质代谢、信号传导和调节中起着至关重要的作用。这些颗粒由疏水性三酰甘油和胆固醇酯的核心组成，被磷脂、胆固醇和载脂蛋白等组成的亲水性外壳所包围，根据其密度、大小和蛋白质组成不同，脂蛋白可分为5个主要类别：乳糜微粒(CM)、极低密度脂蛋白(VLDL)、中间密度脂蛋白(IDL)、低密度脂蛋白(LDL)，即主要是含apoB的脂蛋白;以及高密度脂蛋白(HDL)，即主要是含apoA1的脂蛋白(见表1)。血浆脂蛋白因其大小、组成和代谢特性方面有所不同又可以进一步分为几个亚组分，在心血管疾病(cardiovascular diseases,CVD)尤其是动脉粥样硬化发病中发挥重要作用。目前血浆脂蛋白常根据超速离心法(ultracentrifugation,UC)对其进行分离；此外，脂蛋白也可以根据其电泳迁移率或其载脂蛋白的含量进行分离，以进一步分离脂蛋白并建立相应的脂蛋白谱。尽管目前对于脂蛋白颗粒或亚组分在CVD风险评估中尚无共识，但已有研究表明，LDL和HDL大小或颗粒浓度是未来预测CVD风险的重要检测指标。以下将对几种新型的检测方法进行介绍。

表1 脂蛋白组分分类

1 电喷雾差分电迁移率分析

电喷雾差分电迁移率分析(electrospray differential mobility analysis, ES-DMA)也被称为离子迁移率分析法(ion mobility, IM)，Kaufman等[1]于1998年首次报道该方法用于纳米颗粒和大离子尺寸的测量；Caulfield等[2]在2008年报道了该方法首次应用于脂蛋白分析。ES-DMA是一个可以选择和计算气溶胶相中完整脂蛋白颗粒的系统，其工作原理为用电喷雾接口将血清中的脂蛋白雾化，随后电喷雾接口中的中和源向生成的气溶胶施加已知的电荷分布，在下游使用由漂移管组成的差分电迁移率分析仪来选择雾化的脂蛋白，根据大气压下的电迁移率逐渐选择在大气压力下经受电场倾斜的脂蛋白，然后在凝结核粒子计数器中通过激光检测并对选定的脂蛋白进行计数。ES-DMA已被证明其在脂蛋白检测中具有一定价值，但在临床实验室中几乎没有开展该项目。对于ES-DMA来说自动化和大样本检测是可以实现的；此外，ES-DMA对干扰尤其是血清蛋白产生的干扰相对较敏感，因此通常需要特定的样品制备步骤来获得精确的脂蛋白谱。尽管如此，ES-DMA的一个优点是它可以在短时间内检测出样品的完整脂蛋白谱，与报道的大多数脂蛋白谱分析和定量方法不同，ES-DMA是唯一一种被测物是完整脂蛋白的方法[3]。

2 垂直自动分离法

垂直自动分离法(vertical auto profile,VAP)由Chung等[4]在80年代首次报道。该方法是一种半自动化的系统，其原理主要是通过顺序超速离心进行脂蛋白分离。

VAP-Ⅱ®检测脂蛋白谱有两个过程。首先，通过单垂直旋转密度梯度UC分离脂蛋白，不连续的梯度可确保根据脂蛋白各自的浮悬率充分分离脂蛋白，使密度最高的最终位于管的底部；自动连续酶促测定法通过胆固醇含量对这些分离的脂蛋白进行定量；然后在505 nm处测量吸光度以确定每个脂蛋白类别和亚类相关的胆固醇浓度，从而提供脂蛋白谱。此外，可通过软件中包含的算法将胆固醇浓度进一步转换为apoB的等效浓度。梁纯子等[5]研究得出VAP血脂分型检测在传统实验室血脂项目的基础上增加了特殊内容，使患者脂质数据更有临床操作性、耗时更少、信息更丰富，避免了多重检测带来的经济负担和时间压力。该系统经历了各种优化，并由Atherotech在2016年对其进行了优化[3]，VAP-Ⅱ-fingerstick®(VAP-Ⅱ-fs)可通过少量的血浆(18 μL)检测出患者的脂蛋白谱，而VAP-Ⅱ是具有更好分辨率和性能的系统，但用该方法检测需要更多的患者血浆。VAP在我国的临床应用需要多地区、多中心的研究数据支撑。

3 核磁共振波谱法

核磁共振波谱(nuclear magnetic resonance, NMR)是一种能够分析脂蛋白颗粒的新型检测技术，其原理主要取决于不同脂蛋白颗粒中脂质的甲基部分以不同的频率共振，因此脂蛋白可以通过将核心脂质的甲基信号分解为单个信号，或在整个甲基包膜上使用统计方法估算脂质浓度来定量。当前已有3种方法使用NMR对脂蛋白颗粒进行检测。Otvos[6-7]所描述的方法提供了主要脂蛋白类型(VLDL、LDL和HDL)的大小和颗粒数以及9种脂蛋白亚类的颗粒数，此方法基于某种算法将其NMR甲基信号与血清或血浆样品中脂蛋白的NMR信号进行拟合，通过透射电子显微镜和梯度凝胶电泳确定分离的脂蛋白部分的粒度。 Kaess等[8]描述的第2种方法通过磁场梯度强度和温度来测量样品的12种脂蛋白亚类。Ala-Korpela等[9-11]描述的第3种方法估计主要脂蛋白类别的脂质含量、大小和颗粒数量，以及14种脂蛋白亚类的颗粒数量并且通过高效液相色谱获得的颗粒粒径。目前对将基于NMR的高级脂蛋白检测方法引入临床实践仍存在一些争议，作为NMR方法的替代方法，研究人员开发出了一种基于二维扩散有序1H NMR光谱(2D diffusion-ordered 1H NMR spectroscopy, DOSY)用来检测脂蛋白颗粒的新方法，也被称作Liposcale测试[12-13]。NMR需要训练有素的技术人员和精密的仪器，脂蛋白的定量准确性很大程度上取决于用于信号解卷积的处理软件，该软件使用实验库来处理高度复杂的光谱，目前没有找到有关建立处理算法的方式或系统校准的数据，结果的溯源性仍然不清楚；但脂蛋白谱检测自动化、更少的分离步骤、检测时间缩短和患者负担得起的测定方法使其逐渐在临床试验中广泛得到使用。

4 凝胶渗透高效液相色谱法

凝胶渗透高效液相色谱法(gel permeation-high-performance liquid chromatography,GP-HPLC)由Hara等[14]于1980年首次报道，近来，该方法被用于常规和高通量脂蛋白谱测量，涉及自动数据处理的GP-HPLC系统被称为LipoSEARCH®，该系统已被全球许多研究人员所使用，发表文章近300多篇[15-16]。GP-HPLC根据尺寸排阻色谱(size exclusion chromatography, SEC)的原理按照其水合粒径的不同而分离脂蛋白。Oda等[17]和Yanai等[18]建立了一种新方法，即阴离子交换高效液相色谱法(anion-exchange high-performance liquid chromatography,AEX-HPLC)，并评估了AEX-HPLC在冠心病、糖尿病和肾病患者以及健康志愿者中的临床有效性，结果表明通过AEX-HPLC测定的IDL和VLDL中的胆固醇水平可能是冠心病或糖尿病的危险生物标志物。AEX-HPLC可以代替超速离心法分离人血清中HDL、LDL、IDL、VLDL等5种脂蛋白馏分。该方法还于2014年在日本的公共医疗保险中被批准用于临床。HPLC作为脂蛋白分析的工具，其优点如下：(1)可以从色谱柱中回收样品中的相应成分，并对其进行重复分析；(2)分离过程中样品的降解或变性比超速离心等其他分离技术更低；(3)色谱图的分析简单、容易，因为其分离的基础仅基于粒径。

5 同位素稀释质谱法

同位素稀释质谱法(isotope-dilution mass spectrometry, ID/MS)是临床生物化学检验中许多生物标志物尤其是TG和TC测量的高级参考方法。通过液相色谱ID/MS(liquid chromatography ID/MS, LC-ID/MS)对载脂蛋白进行定量分析由Barr等[19]在1990年代末首次报道，并在接下来的几年中进一步应用于检测其他载脂蛋白(apoA-Ⅰ、apoB、apoC和apoE)。通过LC-ID/MS对载脂蛋白进行绝对定量分析时，需要依靠胰蛋白酶消化血清载脂蛋白,消化后针对每种主要的载脂蛋白鉴定载脂蛋白特异的胰蛋白酶肽，并选择其中一些肽进行ID/MS定量，ID/MS定量使用带有13C、15N或2H作为内标(internal standards, IS)的合成标记实体来加标样品。鉴于该种方法的高精度、良好可比性、可溯源性以及高通量等特点，LC-ID/MS已成为用于血清中apoB和apoA等脂蛋白定量候选参考方法之一。 但是由于这种方法需要使用昂贵的试剂以及专业的的技术人员和精密仪器，因此目前主要用于科研中，尚未应用到临床实验室进行常规检查[20]。

6 高级脂蛋白检测方法可比性

对于高级脂蛋白检测方法可比性的讨论，主要集中于方法之间缺乏标准化，以及每种方法所涉及的测量原理不同。一些方法根据其密度分离脂蛋白，一些根据其大小分离脂蛋白，有些根据其脂质或蛋白质含量分离脂蛋白；类似地，一些方法通过其载脂蛋白成分检测脂蛋白，而另一些方法检测完整的脂蛋白；尽管高级脂蛋白检测方法都旨在测量脂蛋白及其亚类的构成情况，但分离技术和操作条件不同，用这些方法获得结果的可比性和等效性不足；迄今为止，尚无直接比较所有高级脂蛋白检测方法检测结果的报道，大多数仅通过一对一比较，少有研究直接比较几种高级脂蛋白检测方法。2006年Ensign等[21]使用VAP、NMR、梯度凝胶电泳(gradient gel electrophoresis, GGE)和管式凝胶电泳(tube gel electrophoresis , TGE)基于LDL大小测量结果对不同的患者表型分类，结果表明，在39个患者样本中，只有3个被归类为具有相同的LDL表型，即几种方法一致性不到8%。2011年Grundy等[22]在SAFARI(辛伐他汀联合非诺贝特治疗高脂血症)队列研究中通过VAP、NMR和免疫比浊法测量apoB浓度与非HDL-C并进行比较，最终结果显示每种方法得出的apoB浓度一致性较差。

在过去的几十年中，研究工作集中在确定新的生物标志物以更好地预测患者发生CVD的风险上[23]。据报道，大量临床和前瞻性研究旨在证明这些疾病与某一种特定生物标志物的相关性，但是这些研究结果往往受到质疑，特别是关于apoB和LDL颗粒浓度测量之间的相关性[24]。许多专业组织发布了有关CVD风险管理的指南[25-26]，其中关于高级脂蛋白检测方法尤其是apoB浓度测量的争论仍然存在。实际上，最新指南并不一定建议对患者进行风险管理时应使用高级脂蛋白检测方法，并且大多数与高级脂蛋白检测方法相关的综述都表示没有足够的证据来促进高级脂蛋白检测方法在常规中的使用。因此，除非当出现特殊的血脂异常时，大多数监管机构都不建议使用高级脂蛋白检测方法。

7 总结

临床实验室对疾病诊断的作用正在不断发展，以向临床医生提供更多信息，评估CVD风险并更有效地进行靶向治疗。在常规检测中，广泛采用DGUC、免疫比浊法(immunonephelometry, IN)或ELISA等进行脂蛋白定量。全自动性、较低的成本、可接受的精度以及高通量分析等优点使它们成为常规脂蛋白检测的方法；然而，对脂蛋白谱的高度关注导致了许多其他高级脂蛋白检测方法的发展，这些新方法依赖于各种分离原理，这些原理利用脂蛋白的不同特征来建立脂蛋白谱，例如它们的脂质含量、载脂蛋白含量或大小。尽管目前已有许多方法都用于检测脂蛋白谱(见表2)，但由于各种方法在检测脂蛋白亚组分中缺乏统一标准、数据相关性和结果可比性，在一定程度上可能会导致不同的临床诊断和医疗决策，对研究脂蛋白亚组分与CVD等相关疾病之间的关系产生影响。为了解决这一问题，我们应在脂蛋白分离检测方法以及检测指标标准化等方面做出更多努力，为评估脂蛋白亚组分在CVD等疾病发病风险和预后中提供帮助。

表2 高级脂蛋白检测检测方法的优缺点比较