胶体金标免疫固相膜检测动物性食品中氟甲喹

2020-03-23刘卫华于文龙杨茜王向红

食品研究与开发 2020年5期

刘卫华，于文龙，杨茜，王向红

（河北农业大学食品科技学院，河北保定071000）

食品的安全危害主要来自农药、兽药以及饲料添加剂等[1]。随着我国养殖业的发展，兽药及饲料添加剂广泛应用，滥用和超标使用的问题一直存在，造成残留。兽药残留的危害主要有毒性作用、过敏及变态反应、致癌或致畸变等[2]。氟甲喹（flumequine，FLU）属于第二代喹诺酮类抗菌药物，用于预防和治疗畜禽类、鱼类、虾蟹类的疾病，作用机理是通过抑制细菌DNA解旋酶的作用，抑制细菌核酸的合成，从而起到杀菌的效果[3]。一些学者研究了氟甲喹的毒性及危害[4-6]。低剂量的氟甲喹对人及和动物产生的危害虽没有明确的报道，但长期摄入含氟甲喹残留的食品，可能对人体健康产生潜在的危害。

为了保障动物性食品的安全，保护消费者的健康，世界各国都对氟甲喹的残留限量作出了规定。欧盟规定，FLU 的最高残留量为：牛、羊、猪肌肉中200 μg/kg，肝脏中 500 μg/kg；牛奶中 50 μg/kg；家禽肌肉中 400 μg/kg，其它种类：肌肉中 200 μg/kg[7]。2002年，我国农业部发布公告，规定FLU 的最高残留量为：牛、羊、猪肌肉中 500 μg/kg，肝脏中 500 μg/kg，奶中50 μg/kg；鸡肉中 500 μg/kg[8]。2018 年 6 月 13 日，加拿大食品检验局发布水产品药物残留监测清单，明确规定不接受使用氟甲喹[9]。为加强动物性食品安全的监管，研究新型、简便、快速、灵敏度高的氟甲喹检测方法十分重要。

国内外有关氟甲喹检测的方法主要是仪器分析法[10-13]、免疫分析法[14-16]及其它方法。相比之下，免疫分析法具有成本低、操作简单、快速、特异性强、灵敏度及准确性较高等优点，很适合大量样本的筛查。固相膜免疫检测技术是一种基于抗原抗体结合反应原理、以微孔膜作为固相载体的免疫检测技术，其最常用的标记物是胶体金。其特点是检测速度快、灵敏度高、特异性强、操作方便、结果直观，无需仪器[17]。目前已有氟甲喹固相膜免疫分析方法的报道[18-19]，但检测的灵敏度和准确性还有待提高。本研究针对动物性食品中的氟甲喹残留问题，建立灵敏度和准确性较高的胶体金标记固相膜免疫检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

氟甲喹、氯金酸（HAuCl4）：上海源叶生物科技有限公司；鸡卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、福氏不完全佐剂、福氏完全佐剂、过氧化氢脲（CH6N2O3）：美国Sigma 公司；磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O），磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）、柠檬酸三钠：天津科密欧化学试剂公司；Protein ASepharose CL-4B 凝胶层析柱：北京市热景生物技术有限公司；硝酸纤维素膜（nitrocellulose filter membrane，NC）：美国 Millipore 公司。

DYCZ-24KS 垂直电泳仪：北京市六一仪器厂；GL-10000C 冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；99-1 型磁力搅拌器：常州市国华仪器有限公司；Sk-1 型旋涡混匀器：海门市麒麟医用仪器厂；UV-2800 紫外可见分光光度计：尤尼克（上海）仪器有限公司；toppeffe 单道微量可调移液器：上海大龙医疗设备有限公司；Multiskansky 全波长酶标仪：美国Thermo 公司；96 孔酶标板：广州洁特生物过滤股份有限公司。

纯牛奶、虾肉、牛肉、猪肉、猪肝：河北省保定市沃尔玛超市。

试验动物为2 只健康的新西兰大耳白兔，雄性，6 周龄，体重约为 1.5 kg。

1.2 完全抗原的合成与鉴定

选用BSA 和OVA 作为载体，采用活泼酯法将FLU 与载体进行偶联，制备免疫原FLU-BSA 和包被原FLU-OVA。

采用紫外分光光度法和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）法对获得的偶联物进行鉴定。

1.3 氟甲喹多克隆抗体的制备与纯化

以FLU-BSA 为免疫原，免疫新西兰大耳白兔，在颈背部皮下六点和大腿肌肉两点注射，一共免疫6 次。第六次加强免疫10 d 之后，心脏取血，采用间接竞争ELISA 法测定抗血清的效价和亲和力[20]。

采用ProteinA-Sepharose 4B 凝胶柱层析法对抗体进行纯化[21]，并采用紫外分光光度法和间接竞争ELISA法鉴定抗体的纯化效果。

1.4 胶体金及金标抗体的制备

1.4.1 胶体金的制备及质量鉴定

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金[22]。

先通过肉眼观察胶体金溶液的透明度和颜色以及是否有漂浮物，初步判断其质量。量取3 mL 的胶体金溶液，在450 nm～600 nm 范围内进行紫外扫描，确定其最大吸收峰的波长，并对金颗粒的大小做出初步的估计。

1.4.2 胶体金与FLU 抗体结合最适pH 值的确定

分别用0.1 mol/L K2CO3或0.1 mol/L HCl 将胶体金溶液的 pH 值调节为 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0（为了防止胶体金堵塞pH 计的电极，故用精密pH 试纸进行测定）；取100 μL 上述溶液，分别添加到酶标板的孔里，再向每孔中加入0.5 mg/mL 的氟甲喹抗体6 μL，同时设对照组，混合均匀后室温下静置15 min；每孔添加20 μL 的10%NaCl 溶液（对照组添加等体积去离子水），混合均匀，525 nm 波长处测定OD 值。

1.4.3 胶体金标记最佳抗体加入量的确定

用硼酸盐缓冲液将抗体稀释到0.5 mg/mL，依照表3 的方法确定稀释后抗体的加入量，对照管中只加硼酸盐缓冲液。于525 nm 处测吸光值，绘制吸光值-抗体量曲线。曲线发生转折处所对应的抗体量即是需要的抗体量；在此基础上增加10%～20%，即是使1 mL 胶体金溶液稳定实际所需要抗体的最小量。稳定胶体金溶液所需氟甲喹抗体量的优化方案见表1。

表1 稳定胶体金溶液所需氟甲喹抗体量的优化方案Table 1 Optimization methods of FLU antibody quantity for stabilizing colloidal gold solution

将稀释后抗体、硼酸盐缓冲液和胶体金溶液混合均匀后，静置 5 min，分别加入 100 μL 10%NaCl，混合均匀后静置10 min，于525 nm 下测吸光值。

1.4.4 金标抗体的制备

于磁力搅拌下，逐滴地将抗体加入10 mL 胶体金溶液中，搅拌10 min；逐滴加入10 % BSA，一直加到溶液中的BSA 浓度达到1%，缓慢地搅拌30 min，4 ℃下静置12 h 过夜。以10 000 r/min 的速度4 ℃离心30 min，将上清液去除，加入金标抗体储存液至原体积的1/10，备用。

1.5 胶体金标记固相膜的制备

固相膜选用硝酸纤维素膜，在其上面分别包被酶标羊抗兔二抗和FLU-OVA 作为C 带（控制线）和T 带（检测线），二者之间间隔5 mm，37 ℃固定15 min，再用5%脱脂乳封闭30 min 后，用含吐温-20 的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline with Tween 20，PBST）冲洗 3 次，37 ℃干燥后，4 ℃保存。

将金标抗体与待测液混合均匀后，滴加到反应区。观察T 带和C 带的显色，根据显色情况进行检测结果的判断。结果判断如图1 所示。

图1 胶体金标记固相膜结果判断Fig.1 Results judgment of colloidal gold labeled solid phase membrane

1.6 胶体金标记固相膜检测条件的优化

1.6.1 封闭液的优化

以1%明胶、1%BSA、1%酪蛋白、5%脱脂乳、5%甘氨酸封闭胶体金标记固相膜，对照则不经任何处理。观察显色情况，选择固相膜的显色条带清晰并且没有背景色的封闭液为优化的结果。

1.6.2 酶标二抗稀释倍数的优化

以0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液（0.01 mol/L phosphate buffered saline，1× PBS）溶液稀释酶标二抗，分别稀释20、40、80、160、320 倍，然后将其涂在硝酸纤维素膜上，作为控制线（C 带）。进行显色后，比较C 带与T 带的显色情况。

1.6.3 包被原包被量与金标抗体稀释倍数的优化

用 0.5、1.0、1.5 μg 的包被原在硝酸纤维素膜上包被。用抗体储存液按 1：1、1：5、1：10（体积比）的比例将免疫金稀释后，滴加到包被区，观察显色情况，比较显色的强弱。

1.6.4 氟甲喹标准品与金标抗体混合比例的优化

将免疫金分别与浓度为 0、20、40 μg/L 的氟甲喹标准溶液按照 1 ∶1、1 ∶5、1 ∶10（体积比）混合，滴加到包被区进行显色。

1.7 最低检出限的确定

将 0、10、20、40 μg/L 的氟甲喹标准品分别与金标抗体混合，反应5 min 后，再与包被原进行竞争反应，观察显色情况，与空白对照相比，出现明显色差时所对应的最小浓度即为最低检出限。

1.8 实际样品的测定

1.8.1 样品的基质消除

准确称取牛奶（脱脂后的）、虾肉、牛肉、猪肉、生猪肝、熟猪肝样品各1.0 g，加入6 mL 1%的乙酸乙腈溶液，超声处理5 min 后，3 500 r/min 离心5 min。取上清液加入3 mL 的正己烷，涡旋混匀1 min，离心5 min，取下层的液体过0.22 μm 有机滤膜后，备用。

用0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液（0.01 mol/L phosphate buffered saline，1×PBS）将样品提取液分别稀释 0、10、20、40、80 倍，用胶体金标记固相膜进行测定，观察显色情况，找出背景颜色与对照颜色接近时样品提取液的稀释倍数，确定样品基质消除的最佳方法。

1.8.2 样品的加标回收测定

分别向牛奶（脱脂后的）、虾肉、牛肉、猪肉、生猪肝、熟猪肝等6 个样品中，加入3 个不同浓度水平的氟甲喹标准品溶液，按1.8.1 进行基质消除，使稀释后的最终浓度为0、40、60 μg/L，用胶体金标记固相膜测定结果。

2 结果与分析

2.1 完全抗原的鉴定

2.1.1 紫外分光光度法

由FLU 半抗原、载体蛋白BSA、OVA 及其偶联物FLU-BSA、FLU-OVA 的紫外光谱图可知，FLU 与载体蛋白BSA、OVA 发生偶联后，得到的产物FLU-BSA 和FLU-OVA 的紫外扫描光谱图与 FLU、BSA 和 OVA 的紫外扫描光谱图相比，吸收曲线发生了变化，最大吸收峰的吸光值增加了，这证明载体蛋白上连接上了一定量的FLU 半抗原。

2.1.2 SDS-PAGE 分析法

通过载体蛋白与抗原偶联的电泳结果可知，FLUBSA 的条带略滞后于BSA 条带，FLU-OVA 条带也略滞后于OVA 条带。SDS 使蛋白质的结构发生变化，形成蛋白质亚基，蛋白质亚基的迁移率主要取决于其分子量，而可以忽略电荷的影响。分子量大的迁移率小，反之则大[21]。由此即可判断，人工合成完全抗原分子量比载体蛋白分子量大，说明人工抗原合成成功。

2.2 氟甲喹多克隆抗体的制备及纯化

2.2.1 抗血清效价的测定

抗血清效价随着免疫次数的增加而呈现出明显的上升趋势，从第一次取血到最后一次心脏取血，抗血清效价均从1 600 升高到较高的12 800。

2.2.2 抗血清亲和力测定

图2 为4 次取血后测定的抗血清亲和力的变化图。

由图2 可以看出，随免疫次数增多，FLU 的抑制率逐渐增大，IC50从 19.79 μg/mL 降低至 0.213 ng/mL。

2.2.3 抗血清纯化及纯化效果鉴定

抗体纯化曲线见图3。

经过计算得出，纯化后抗体的浓度为0.64 mg/mL。图4 为抗血清在纯化前和纯化后的紫外扫描图。

图2 抗血清亲和力的变化图Fig.2 Changes of antiserum affinity

图3 ProteinA-Sepharose-4B 凝胶柱层析法纯化抗血清的色谱图Fig.3 Antiserum purification by ProteinA-Sepharose-4B column chromatography

图4 抗血清在纯化前和纯化后的紫外扫描图Fig.4 Ultraviolet spectrum of antiserum before and after purified

从图4 可看出，在纯化前的抗血清紫外扫描图中，出现在波长415、537 nm 和578 nm 处的峰是由抗血清中影响抗原抗体特异性反应的杂质（例如血红蛋白、脂类、维生素以及无机物）所形成的；而在纯化后的抗血清紫外扫描图中，杂质峰消失了，只有280 nm 波长处存在一个明显的蛋白质吸收峰。这说明，抗血清经过纯化后得到的抗体蛋白较为单一。图5 为抗血清纯化前和纯化后的亲和力变化图。

图5 抗血清纯化前和纯化后的亲和力变化图Fig.5 Changes of antiserum affinity before and after purified

从图5 可以看出，经过纯化后，抗血清与抗原的亲和力得到了显著的提高，灵敏度IC50和检测限IC15均显著地降低。这说明，抗血清纯化能够明显增强抗原和抗体的特异性反应。

2.3 胶体金的质量鉴定

通过肉眼观察，制备的胶体金无杂质，表面无漂浮物，澄清透明，呈酒红色。可以初步判断，胶体金颗粒大小比较均匀，质量比较好。

由胶体金溶液的紫外光谱图可知，在525 nm 处有最大吸收峰。根据最大吸收波长（y）与金颗粒直径（x）的线性回归方程y=0.427 1x+514.56[22]，计算出胶体金颗粒直径为24.4 nm。

2.4 胶体金与FLU抗体结合最适pH值的确定

图6 为与抗体结合的胶体金溶液pH 值范围的优化结果。

图6 胶体金溶液pH 值范围的优化Fig.6 Optimization of pH of colloidal gold

当pH 值大于或等于7.0 时，吸光值趋于稳定。一般认为，在大于等于等电点时，被标记的蛋白质呈现电中性，表面张力最大，而且不易聚集，最容易形成牢固的胶体金-蛋白质复合物，使胶体金处于稳定的状态，电解质不能将它破坏。所以，确定标记抗体所用胶体金的pH 值为9.0。

2.5 胶体金标记最佳抗体加入量的确定

图7 为抗体用量的优化试验结果。

图7 抗体蛋白用量的优化Fig.7 Optimization of antibody protein dosage

与目测的结果一致，当抗体用量<12 μg 时，有很多游离的金颗粒存在于溶液中，氯化钠产生的盐离子效应会使胶体金溶液由红变蓝、出现沉淀；当抗体用量≥12 μg 时，胶体金溶液始终保持红色，且没有沉淀产生，吸光值趋于稳定。故选择氟甲喹抗体的加入量为12 μg，在此基础上增加20%，确定为实际的抗体需要量。

2.6 胶体金标记固相膜检测条件的优化

2.6.1 封闭液的优化

从胶体金固相膜封闭液的优化结果可以看出，没有进行封闭处理的NC 膜在显色后，条带较宽；经5%甘氨酸处理的显色条带宽且背景色深；经1%BSA 封闭处理的几乎看不到显色条带，背景色很深；经1%明胶和1%酪蛋白封闭的显色及背景的颜色都比较浅；经5%脱脂乳封闭的NC 膜在显色后，条带颜色很鲜明，且基本上无背景色。而以5%脱脂乳作为封闭液，成本较低且易于取得，因此，本试验的封闭液确定选用5%脱脂乳。

2.6.2 酶标二抗稀释倍数的优化

从酶标二抗的稀释倍数优化结果可以看出，随酶标二抗稀释倍数增大，C 线的显色变得越来越浅，直至肉眼看不出来。当酶标二抗稀释40 倍时，C 线的显色与T 线接近，容易判断结果。当酶标二抗稀释20 倍时，可以明显地看出，C 线的显色比T 线深；当酶标二抗稀释倍数过大时，C 线的显色明显地比T 线浅，则梯度差距不大，均不利于结果的判断。所以，酶标二抗的最佳稀释倍数选定为40。

2.6.3 包被原包被量与金标抗体稀释倍数的优化

包被原包被量及金标抗体稀释倍数直接影响到固相膜的显色，需进行优化。其优化的结果见表2。

从表2 可以看出，包被原包被量为0.5 μg 时，检测线显色偏浅，说明结合的金标抗体比较少；包被原包被量为1.5 μg 时，检测线显色则偏深；包被原包被量为1.0 μg 时，检测线显色较为理想，所以选择包被量为1.0 μg。金标抗体稀释倍数为5 时，所有包被量的固相膜显色均较为理想。因此，确定包被原包被量1.0 μg、金标抗体稀释5 倍为最优。

2.6.4 氟甲喹标准品与金标抗体混合比例的优化

当金标抗体与氟甲喹标准品溶液的混合比例为1 ∶1（体积比）时，检测线的颜色及背景的颜色都比较深，对于不同浓度的氟甲喹标准溶液，看不出明显的差异，不易观察和判断；当金标抗体与氟甲喹标准品溶液的混合比例为1 ∶10（体积比）时，尽管检测灵敏度提高了，但显色整体上都比较浅，也不易观察和判断。而当金标抗体与氟甲喹标准品溶液的混合比例为1 ∶5（体积比）时，都容易进行观察和判断。因此，确定金标抗体与样品溶液的混合比例为1 ∶5（体积比）。

2.6.5 最低检出限的确定

在优化的条件下，用试验制备的胶体金标记固相膜对氟甲喹进行测定，检测结果见图8。

图8 固相膜检测结果Fig.8 Detection result of the solid phase membrane

由图8 可以看出，随氟甲喹浓度逐步提高，检测线的颜色逐步变得越来越浅；氟甲喹浓度<40 μg/L 时，虽然可以看见T 线的颜色，但其颜色与空白对照相比，无法通过目测区分开；当氟甲喹浓度≥40 μg/L 时，T线的颜色变浅，能够通过目测将T 线的颜色与空白对照的颜色区分开。因此，该胶体金标记固相膜对氟甲喹的检出限为40 μg/L，比文献报道的基于多克隆抗体的固相膜检测方法的检出限低[18-19]。