罗汉果咀嚼片制备工艺的优化及抑菌活性研究

何怡，刘翰飞，林冰，岳静，周英，张俊连

（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳550025；2.贵州中医药大学，贵州贵阳550025；3.贵州德江易盛农业科技发展有限公司，贵州铜仁554300）

罗汉果（Siraitia grosvenorii）为葫芦科多年生草质藤本植物罗汉果的干燥成熟果实，为中国特有的药食同源植物，中医上认为其具有清热润肺，利咽开音，滑肠通便等效用[1]。罗汉果主要分布于两广、贵州、江西、湖南等地区[2]。罗汉果含有大量的黄酮类，酚酸和萜类以及碳水化合物，蛋白质，氨基酸和维生素成分[3-5]。除在中国药典中公布的药用特性外，国内外研究人员还研究了罗汉果及其提取物的其他作用，如活性氧（reactive oxygen species，ROS）清除，抗炎和抗癌活性，抗疲劳，免疫调节，以及血脂代谢的调节以及血脂代谢的调节血糖代谢的改善[6-15]。罗汉果苷V 是一种葫芦烷三萜皂苷，是罗汉果的主要生物活性成分[16]。咀嚼片是一种实用且方便有效的片剂形式。经嚼碎后，药片的表面积增大，可促进药物在人体内的代谢吸收。制成咀嚼片可使一些难崩解的药物加速崩解，提高药物的疗效[17]。

本研究以罗汉果浸膏为主药，添加适当的辅料，研制出口感爽口、食用方便的罗汉果咀嚼片，并建立了罗汉果皂苷V 的含量测定方法，对其抑菌活性进行了研究，为罗汉果等药食同源药物的开发和利用提供了依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

罗汉果由贵州德江易盛农业科技发展有限公司提供，经贵阳中医药大学魏升华教授鉴定为罗汉果[Siraitia grosvenorii（Swingle）C Jeffrey ex A.M.Lu et Z.Y.Zhang]的干燥果实；罗汉果皂苷V 标准品：四川维克奇生物科技有限公司，纯度≥98 %；淀粉、微晶纤维素钠、甘露醇、无水柠檬酸、硬脂酸镁：河南亚统食品原料有限公司；蒸馏水；甲醇、乙腈为色谱纯：Fisher 公司；水：娃哈哈纯净水；金黄色葡萄球菌（BNCC 186335）；铜绿假单胞杆菌（CMCC 10104）；枯草芽孢杆菌（CMCC 63501）；移液枪及配套枪头：大龙；营养肉汤、营养琼脂：上海博微生物科技有限公司；MH 琼脂培养基、MH肉汤培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基：杭州百思生物技术公司；抗生素药敏纸片：杭州微生物试剂有限公司。

RE-52CS 旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；药检筛：上虞市瑞志仪器厂；DGG-8501A 型电热恒温干燥箱：上海齐欣科学仪器有限公司；5T 油压式压片机：鹤壁市鑫利煤质仪器有限公司；FA2004 型电子天平：上海象平仪器仪表有限公司；HH-4 数显恒温水浴锅：上海浦东物理光学仪器厂；KH-500DE 型超声波清洗器：昆山禾创超声仪器有限公司；PTF-DR 全自动脆碎度测定仪：德国Pharma-test 公司；1260 型自动进样高效液相色谱仪：美国安捷伦公司；HWS-150 恒温恒湿培养箱：北京科伟永兴仪器有限公司；SW-CJ-1FD 超净工作台：苏州净化设备有限公司；ZWYR-2102C 恒温培养振荡器：上海智诚分析仪器制造有限公司；30KBS 高压灭菌锅：上海中安医疗器械厂；WH-2 微型涡旋混合仪：上海沪西分析仪器厂有限公司。

1.2 工艺流程

罗汉果→干燥（30 min）→粉碎→水浴提取→抽滤→浓缩→罗汉果浸膏（+辅料）→混合干燥（60 ℃，30 min）→研磨→过筛（200 目）→（+硬脂酸镁）→压片

1.3 操作要点

1.3.1 罗汉果浸膏的制备

称取罗汉果粉末10 g，置于500 mL 烧杯中，加入100 mL 蒸馏水，置于70 ℃恒温水浴锅上加热提取120 min，过滤得滤液，减压旋干得浸膏，称量得浸膏总质量为4.881 g，得膏率为48.81%。

1.3.2 混合干燥

罗汉果浸膏易吸水，加入辅料后需干燥，置于60 ℃烘箱中，干燥30 min，然后再研磨过筛。

1.3.4 压片

加硬脂酸镁作为润滑剂，控制压片压力在5 kN。

1.4 罗汉果咀嚼片配方的研究

本研究以罗汉果浸膏为主药，选用淀粉、微晶纤维素、甘露醇、柠檬酸、硬脂酸镁等辅料，进行罗汉果咀嚼片的制备。因罗汉果浸膏、柠檬酸、甘露醇的添加量对咀嚼片口感的影响较大，进行单因素、正交试验，以得到其最佳制备配方。淀粉和微晶纤维素的添加量则根据罗汉果浸膏、柠檬酸、甘露醇的添加量而调整比例。

1.4.1 单因素试验

1.4.1.1 罗汉果浸膏的考察

罗汉果浸膏的比例会对整个咀嚼片的风味影响较大。因此，针对罗汉果浸膏添加量的单因素试验，设计25%、20%、15%、10%、5%罗汉果浸膏添加量进行单因素考察。

1.4.1.2 柠檬酸的考察

采用甘露醇、淀粉、柠檬酸、微晶纤维素钠等辅料，考虑到柠檬酸对口味影响较大，因此设计0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%柠檬酸含量进行单因素试验。

1.4.1.3 甘露醇的考察

罗汉果虽具有它特有的味道，甘露醇可以增加其清爽的口感，因此设计甘露醇含量5%、10%、15%、20%、25%进行单因素试验。

1.4.2 正交试验

在单因素试验的基础上，选取考察因素为罗汉果浸膏、柠檬酸、甘露醇，每个因素3 个水平。设计正交试验表，表1 为因素水平。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design for optimizing theformulation

1.5 质量控制与评价

根据《中国药典》2015 版对于咀嚼片的质量标准检测方法，对罗汉果咀嚼片的片重差异、脆碎度、微生物指标、感官评价，罗汉果皂苷V 含量等指标进行检测。

1.6 感官评价

根据片剂感官评分，包括外观（20 分）、风味（40分）、质地（20 分）、口感（20 分），将每一项目分为 3 个等级进行打分。每一项目的等级以及分值都进行合理设计，得出感官评分标准设计表，见表8[18]。评分满分为100 分，由10 人组成评鉴小组，以感官评价法进行评分，以平均分计算。

表2 罗汉果感官评分标准设计表Table 2 Sensory evaluation standards of mogroside chewing tablets

1.7 罗汉果咀嚼片中罗汉果皂苷V 的含量测定

1.7.1 色谱条件

色谱柱：Agilent 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈 ∶水=21 ∶79 体积比；检测波长：203 nm；流速：1 mL/min；进样量：8 μL；柱温：30 ℃。

1.7.2 标准品溶液

精密称取10 mg 罗汉果皂苷V 标准品，置25 mL容量瓶中，加入适量流动相，振摇溶解，并定容至刻度，摇匀，即得浓度为0.4 mg/mL 标准品溶液。

1.7.3 供试品溶液

按照“1.2”项下制备得罗汉果咀嚼片，研磨成粉末，精密称取0.5 g 置于10 mL 容量瓶中，加入适量流动相，超声（150 W，40 kHz）15 min，定容至刻度，摇匀并用0.45 μm 微孔滤膜滤过，备用。

1.7.4 系统适用性试验

对照品溶液和供试品溶液，按“1.7.1”项下色谱条件进样色谱分析，测得罗汉果皂苷V 对照品、供试品峰面积，计算其理论塔板数（n）。

1.7.5 线性关系的考察

按照“1.7.2”项下，配制浓度为0.08、0.12、0.16、0.2、0.24 mg/mL 罗汉果皂苷 V 标准品溶液，按“1.7.1”项下的色谱条件进行高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）测定记录峰面积。以罗汉果皂苷 V 浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），绘制标准曲线。

1.7.6 精密性试验

罗汉果皂苷V 对照品溶液，按“1.7.1”项下连续重复进样6 次，测定罗汉果皂苷V 的色谱峰面积，计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.7.7 重复性试验

精密称取0.5 g 同一批罗汉果咀嚼片粉末共6 份，按“1.7.3”项下方法制备供试品溶液，在“1.7.1”项下方法测定罗汉果皂苷V 的色谱峰面积，计算RSD。

1.7.8 稳定性试验

取同一供试品溶液，按“1.7.1”项下方法2 h 进样一次，共6 次，测定罗汉果皂苷V 色谱峰面积。计算RSD。

1.7.9 加标回收试验

精密称取已知含量的罗汉果咀嚼片粉末6 份，按“1.7.3”项下方法制备供试品溶液，分别加入适量罗汉果皂苷V 对照品，稀释后按“1.7.1”项下方法测定峰面积，计算加样回收率。

1.7.10 罗汉果皂苷V 含量测定

分别称取三批咀嚼片各0.5 g 按照“1.7.3”项下方法制备供试品溶液，按“1.7.1”项下的色谱条件测定，记录峰面积，计算罗汉果皂苷V 的含量。

1.8 抑菌活性研究

1.8.1 菌悬液的制备

将供试菌株分别接种于营养琼脂平板上，置37 ℃恒温恒湿培养箱培养18 h～24 h 活化，待用。使用时，挑取琼脂平板上形态相同的菌落，在恒温培养振荡器中摇动24 h。取100 μL 菌悬液逐倍稀释后涂布到平板上，培养后统计菌落数，按照稀释的倍数与接种量计算含菌量（平板菌落计数法）。使用时，将菌悬液的浓度调为1×107CFU/mL，放4 ℃冰箱备用。

1.8.2 供试液的制备

称取50 mg 罗汉果咀嚼片粉末置于10 mL 塑料EP 管中，加入5 mL 水溶解，灭菌备用。

1.8.3 滤纸片法测定抗菌活性

向培养皿中倒入琼脂培养基，凝固后加入100 μL菌液（浓度调整为1×107CFU/mL），均匀涂布。将浸有供试液、链霉素（阳性对照）或水的滤纸片（直径6 mm）置于涂菌平板上，平行3 次，静置5 min。培养皿置于37 ℃恒温恒湿培养箱培养24 h 后，用游标卡尺测量抑菌圈大小。

抑菌圈直径（mm）=测量值（mm）-滤纸片直径（mm）

2 结果与分析

2.1 罗汉果咀嚼片配方单因素试验结果

2.1.1 罗汉果浸膏的考察

以感官评分为指标考察罗汉果浸膏的影响，结果如图1。

图1 罗汉果浸膏添加量对罗汉果咀嚼片感官评价的影响Fig.1 Effect of amount of mogroside extract on sensory quality of mogroside chewable tablets

由图1 可知，咀嚼片中罗汉果浸膏添加量为15%时感官评分最高，故选择罗汉果浸膏15%的添加量制备咀嚼片。

2.1.2 柠檬酸考察

以感官评分为指标考察柠檬酸的影响，结果如图2。

图2 柠檬酸添加量对罗汉果咀嚼片感官评价的影响Fig.2 Effects of amount of citric acid on sensory quality of mogroside chewing tablets

由图2 可知，咀嚼片中柠檬酸添加量为0.5%时感官评分最高，故选择柠檬酸0.5%的添加量制备咀嚼片。

2.1.3 甘露醇的考察

以感官评分为指标考察甘露醇的影响，结果如图3。

图3 甘露醇添加量对罗汉果咀嚼片感官评价的影响Fig.3 Effects of amount of mannitol on sensory quality of mogroside chewing tablets

由图3 可知，甘露醇添加量为20%时感官评分最高，故选择甘露醇20%的添加量制备咀嚼片。

2.2 正交试验结果

以感官评价为指标，正交试验结果如表3。

表3 正交试验结果Table 3 Results of orthogonal test

由表3 的极差R 可以说明，对罗汉果咀嚼片影响的主次关系为罗汉果浸膏＞甘露醇＞柠檬酸，其最佳组合是A2B2C2，即罗汉果浸膏为15%，柠檬酸为0.5%，甘露醇为20%。

2.3 质量控制与评价结果

2.3.1 外观性状

罗汉果咀嚼片表面色泽均匀、无异物、无任何杂斑。

2.3.2 片重差异

测得罗汉果咀嚼片平均片重为0.258 6 g，片重范围在 0.250 4 g～0.271 6 g，片重差异范围-3.31%～4.81%，符合中国药典规定。

2.3.3 脆碎度

所有咀嚼片均未检出断裂、龟裂及粉碎的片剂，且咀嚼片减失质量为0.005 4 g，为0.83%，符合中国药典规定。

2.3.4 微生物指标

咀嚼片中的细菌总数≤750 CFU/g；大肠菌群≤30 MPN/100 g；霉菌≤25 CFU/g；酵母菌≤25 CFU/g；致病菌（沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌），不得检出。

2.3.5 感官评价结果

感官评定为10 人小组评定结果见表4。

从表4 感官评价结果可以看出，15%浸膏、33 %淀粉、25 %微晶纤维素、20 %甘露醇、0.5 %柠檬酸、1.5%硬脂酸镁为最佳配方。

表4 感官评价结果Table 4 Results sensory evaluation

2.4 罗汉果咀嚼片中罗汉果皂苷V的含量测定结果

2.4.1 系统适用性试验

经HPLC 测定罗汉果皂苷V 对照品、供试品图谱如图4。

图4 罗汉果皂苷V 的HPLC 图Fig.4 HPLC chromatograms of mogroside V standard

按“1.7.1”项下色谱条件分析，得罗汉果皂苷V 对照品、供试品色谱图，计算得两者理论塔板数均大于17 000。在该色谱条件下，样品的分离较好。

2.4.2 线性关系的考察

以罗汉果皂苷V 浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），绘制标准曲线，计算得回归方程y=1 916.5x-5.96，R2=0.999 2，结果表明，罗汉果皂苷V 的含量在0.08 mg/mL～0.24 mg/mL 的范围内具有良好的线性关系。

2.4.3 精密性试验

罗汉果皂苷V 对照品溶液，按“1.7.1”项下连续重复进样6 次，测定罗汉果皂苷V 的色谱峰面积，计算RSD 为0.80%，表明仪器的精密度良好。

2.4.4 重复性试验

精密称取0.5 g 同一批粉末共6 份，按“1.7.2”项下方法制备供试品溶液，在“1.7.1”项下方法测定罗汉果皂苷V 的色谱峰面积，计算RSD 为0.82%，表明该方法重现性良好。

2.4.5 稳定性试验

取同一供试品溶液，按“1.7.1”项下色谱方法2 h进样一次，共6 次，测定罗汉果皂苷V 色谱峰面积，计算RSD 为0.54%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.4.6 加标回收试验

精密称取已知含量的罗汉果咀嚼片粉末6 份，按“1.7.2”项下方法制备供试品溶液，分别加入适量罗汉果皂苷V 对照品，稀释后按“1.7.1”项下方法测定峰面积，计算加样回收率，结果见表5。

表5 罗汉果皂苷V 的加标回收试验Table 5 Additive recovery test of mogroside V sample

由表5 可知，罗汉果皂苷V 的平均加样回收率为100.412 %，6 份样品加样回收率均在95 %～105 %之间，且RSD<5%，说明方法的准确度良好。

2.4.7 样品含量测定结果

根据3 批样品色谱峰面积，通过线性方程计算出其含量如表6。

表6 3 个批次罗汉果咀嚼片中的罗汉果皂苷V 含量Table 6 Results of determination of mogroside V content in three batches of mogroside chewing tablets

结果表明，罗汉果咀嚼片中罗汉果皂苷V 含量为3.744 mg/g。

2.5 抑菌活性研究结果

通过罗汉果咀嚼片对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞杆菌的抑菌活性试验，测量其抑菌圈直径，结果如表7 所示。

表7 罗汉果咀嚼片抑菌圈直径Table 7 Diameter of inhibition zone of mogroside chewable tablets

由表7 可知，罗汉果咀嚼片对革兰氏阳性菌敏感，对金黄色葡萄球菌抑菌效果最好，对枯草芽孢杆菌次之，对铜绿假单包杆菌则无抑菌作用。因此，罗汉果咀嚼片具有一定的抑菌活性。

3 结论

本研究以罗汉果浸膏为主药，选用适当的辅料，完成罗汉果咀嚼片的制备。进行单因素、正交试验，得到其最佳制备配方为：浸膏15%、淀粉33%、微晶纤维素25 %、甘露醇20 %、柠檬酸 0.5 %、硬脂酸镁1.5 %。按该配方制成的咀嚼片表面光滑，色泽均匀，具有罗汉果特有的香味且酸甜爽口。经HPLC 测定，咀嚼片中罗汉果皂苷V 含量为3.744 mg/g。抑菌结果表明，罗汉果咀嚼片对革兰氏阳性菌具有一定的敏感性，其中对金黄色葡萄球菌效果最好，对铜绿假单孢杆菌则无抑菌活性。本品配方合理，各项指标均符合药典要求，含片质量稳定，工艺可行，为罗汉果的开发提供了理论依据。