盐浓度、温度和pH值对NaCl诱导的马铃薯直链淀粉自聚集行为的影响

闻燕，唐津忠，彭勃，陈昭国

（1．天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津300134；2．四川大学国家生物医学材料工程技术研究中心，四川成都610064）

一直以来，淀粉被广泛应用于食品、医药、化工等领域。淀粉的晶体结构会影响淀粉产品的热稳定性[1-2]、降解性[3-4]、糊化性质[5-7]和体外消化性能[8]等。

淀粉颗粒为半结晶聚合物，最常见的晶型为A-型和B-型，均以淀粉分子双螺旋为构筑单元[6，9-12]。淀粉分子链的水合情况[7，9-10，12-13]以及分子链间和分子链内的氢键作用[14-16]是影响淀粉晶体结构的关键因素。改变水-淀粉分子间的相互作用，可以破坏淀粉原来的晶体结构，导致淀粉分子双螺旋重排形成新的晶型[9]。

盐的存在会影响淀粉的晶体结构，可能的机理通常分为以下几种：1）盐分子中的阳离子与淀粉羟基之间的静电作用[7，14，16]。2）离子的水合作用[7，12]。前期研究结果表明，盐（NaCl、KCl）的存在可以诱导马铃薯直链淀粉结晶。淀粉浓度固定时，盐浓度降低有利于淀粉结晶[14]。盐分子中的阳离子与淀粉羟基及带负电的磷酸基团之间的静电作用，一方面可以减小磷酸基团带来的淀粉分子内部的静电斥力，稳定淀粉分子的双螺旋结构，有利于其进一步堆积形成更加有序的晶体结构。另一方面，盐-淀粉间的静电作用也会破坏部分淀粉分子内和分子间氢键。盐浓度太高，其对氢键的破坏作用过强，不利于淀粉结晶。本研究采用荧光倒置显微镜和红外光谱分别考察不同盐浓度、pH 值和温度条件下，马铃薯直链淀粉与NaCl 溶液作用不同时间的结晶形貌和化学结构变化，初步探索NaCl 诱导的马铃薯直链淀粉自聚集行为的影响因素，以期为调控淀粉产品的晶体结构及性能提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

马铃薯淀粉（表观直链淀粉含量和总直链淀粉含量分别为19.6%和20.2%）：赤峰天泽生物科技有限责任公司；微生物α-淀粉酶（编号：DF-L-NA 20130730，相对活性20 000 U/mL）：天津诺奥科技发展有限公司；氯化钠（分析纯）：天津市四通化工厂。

1.2 仪器与设备

手提式压力蒸汽灭菌器（YXQG02 型）：山东新华医疗器械股份有限公司；高速离心机（L535-1 型）：湘仪离心机仪器有限公司；荧光倒置显微镜（C-HGFT型）：日本 Nikon 公司；岛津红外光谱仪（IR-1 型）：上海纳锘仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 马铃薯直链淀粉的制备

马铃薯直链淀粉按天津市食品生物技术重点实验室的方法自制[14]。

1.3.2 马铃薯直链淀粉悬液的配制

称取0.4 g 干燥的马铃薯直链淀粉分散于10 mL 不同浓度的 NaCl 溶液中（浓度分别为1、0.5、0.1、0.05 mol/L）。室温（25 ℃）下充分摇匀，分别于 15 min、0.5、1、2、4、6、12、24 h 后离心，收集上清液。一部分上清液供荧光倒置显微镜检测用。另外一部分上清液于60 ℃烘箱中干燥，供红外检测用。以不加NaCl 的马铃薯直链淀粉悬液作对照。

考察温度对NaCl 诱导的马铃薯直链淀粉自聚集行为的影响时，样品制备方法与上述方法相似，只是固定NaCl 溶液的浓度为0.1 mol/L，淀粉悬浮液充分摇匀后置于4 ℃冰箱中存放，收集上清液，备用。以室温（25 ℃）下马铃薯直链淀粉悬液作对照。

考察pH 值对NaCl 诱导的马铃薯直链淀粉自聚集行为的影响时，固定NaCl 溶液的浓度为0.1 mol/L，分别用0.01 mol/L HCl 溶液和0.01 mol/L NaOH 溶液将其pH 值调至pH 5.0 和pH 8.0。按照上述方法制备不同pH 值条件下马铃薯直链淀粉悬液，收集上清液，备用。以不调pH 值的马铃薯直链淀粉悬液（pH 6.5）作对照。

1.3.3 荧光倒置显微镜检测

用一次性胶头滴管滴2 滴马铃薯直链淀粉上清液（质量分数4%）于洁净的载玻片上，室温（25 ℃）下自然晾干。采用荧光倒置显微镜观察上清液中淀粉的结晶形貌。

1.3.4 红外光谱检测

采用KBr 压片法使用岛津IR-1 型红外光谱仪分析不同条件下制得的马铃薯直链淀粉样品的红外光谱。扫描次数为256 次，分辨率为2 cm-1，波长范围为4 000 cm-1～500 cm-1。

2 结果与分析

2.1 盐浓度对马铃薯直链淀粉自聚集行为的影响

室温（25 ℃）下马铃薯直链淀粉与0.1 mol/L NaCl溶液作用不同时间的红外谱图见图1。

图1 室温（25 ℃）下马铃薯直链淀粉与0.1 mol/L NaCl 溶液作用不同时间的红外谱图Fig.1 FTIR spectra of potato amylose crystallites treated with 0.1 mol/L NaCl for different time at room temperature（25 ℃）

位于1 045 cm-1附近的特征峰与淀粉的有序结构/结晶区有关[17-18]。与原马铃薯直链淀粉相比，NaCl 存在条件下，所有马铃薯直链淀粉样品在1 045 cm-1附近的特征峰强度增加，表明NaCl 的加入可以诱导马铃薯直链淀粉分子重排形成更加有序的结构。另外，位于3 433 cm-1

和1 644 cm-1附近的特征吸收峰分别归属于羟基的伸缩振动峰和水分子中羟基的弯曲振动峰强度也普遍增加。这是因为带正电的Na+可以与马铃薯直链淀粉分子链上的羟基之间发生静电作用，并影响其与晶体内部水分子之间的相互作用，导致羟基吸收峰发生变化。这种盐-淀粉间的静电作用破坏了部分马铃薯直链淀粉分子内及分子间氢键，也在一定程度上影响了马铃薯直链淀粉-水分子之间的相互作用[14]。而淀粉分子内及分子间氢键[14-16]，以及淀粉-水分子相互作用[7，9-10，12-13]是影响淀粉分子双螺旋重新排列形成有序的聚集体或晶体结构的重要因素。改变NaCl的浓度，所得马铃薯直链淀粉的红外谱图上特征吸收峰的变化趋势一致（试验结果未给出）。因此，红外谱图的试验结果在一定程度上证实了NaCl 的加入可以诱导马铃薯直链淀粉分子双螺旋重排，形成淀粉聚集体。

采用荧光倒置显微镜可以直观、方便地观察马铃薯直链淀粉与NaCl 溶液作用不同时间的结晶形貌，是考察NaCl 诱导的马铃薯直链淀粉自聚集行为的一种有效手段。

室温（25 ℃），与0.05 mol/L NaCl（pH 值约为6.5）分别作用 15 min，0.5、1、2、4、6、12、24 h 后马铃薯直链淀粉的结晶形貌见图2。

图2 室温（25 ℃）下马铃薯直链淀粉与0.05 mol/L NaCl 溶液作用不同时间的荧光倒置显微镜图片Fig.2 Representative optical micrographs of potato amylose crystallites treated with 0.05 mol/L NaCl for different time at room temperature（25 ℃）

由图2 可以看出，原马铃薯直链淀粉以淀粉颗粒的形式存在（图2I），NaCl 的存在诱导马铃薯直链淀粉形成了高度有序的聚集体。马铃薯直链淀粉分子先形成有序的小的绳状聚集体，并有短枝状聚集体垂直于其长轴方向平行堆积（图2 A2）。小的绳状聚集体进一步堆积成十字形聚集体（图2 D2、E2、F2）。十字形聚集体继续生长，最终形成中间有十字、长绳状聚集体垂直于晶体生长的长轴方向平行堆积的更大的规则聚集体（图 2 G2、H2）。与 0.05 mol/L NaCl 作用 12 h 后，马铃薯直链淀粉的结晶形貌基本不变。

室温（25 ℃），与0.1 mol/L NaCl（pH 值约为6.5）分别作用 15 min、0.5、1、2、4、6、12、24 h 后马铃薯直链淀粉的结晶形貌见图3。

与0.05 mol/L NaCl 溶液相类似，在0.1 mol/L NaCl溶液中，马铃薯直链淀粉形成了高度有序的聚集体（图3），只是晶体生长速度更快。与0.1 mol/L NaCl 溶液作用0.5 h 后就观察到了高度有序的规则聚集体（图3 B2），中间有十字，长绳状聚集体垂直于晶体生长的长轴方向平行堆积，长绳状聚集体的末端连接有小的树状聚集体（图3 B1）。与0.1 mol/L NaCl 溶液作用4 h以后，马铃薯直链淀粉的结晶形貌基本不变。

图3 室温（25 ℃）下马铃薯直链淀粉与0.1 mol/L NaCl 溶液作用不同时间的荧光倒置显微镜图片Fig.3 Representative optical micrographs of potato amylose crystallites treated with 0.1 mol/L NaCl for different time at room temperature（25 ℃）

室温（25 ℃），分别与0.5 和1 mol/L NaCl（pH 值约为 6.5）分别作用 15 min，0.5、1、2、4、6、12、24 h 后马铃薯直链淀粉的结晶形貌见图4 和图5。

图4 室温（25 ℃）下马铃薯直链淀粉与0.5 mol/L NaCl 溶液作用不同时间的荧光倒置显微镜图片Fig.4 Representative optical micrographs of potato amylose crystallites treated with 0.5 mol/L NaCl for different time at room temperature（25 ℃）

图5 室温（25 ℃）下马铃薯直链淀粉与1 mol/L NaCl 溶液作用不同时间的荧光倒置显微镜图片Fig.5 Representative optical micrographs of potato amylose crystallites treated with 1 mol/L NaCl for different time at room temperature（25 ℃）

当NaCl 溶液浓度高于0.1 mol/L 时，NaCl 仍然可以诱导马铃薯直链淀粉形成高度有序的聚集体（图4和图5），只是与0.1 mol/L NaCl 溶液相比，马铃薯直链淀粉晶体生长速度明显减慢。与NaCl 溶液作用24 h以后，马铃薯直链淀粉的结晶形貌基本不变。

图6 给出了马铃薯直链淀粉与不同浓度的NaCl溶液作用6 h 后的荧光倒置显微图。

图6 室温（25 ℃）下马铃薯直链淀粉与不同浓度的NaCl 溶液作用6 h 的荧光倒置显微镜图片Fig.6 Representative optical micrographs of potato amylose crystallites after 6 h treatment with NaCl at different concentrations at room temperature（25 ℃）

当NaCl 溶液浓度为0.1 mol/L 时，马铃薯直链淀粉的晶体生长速度最快（图6 C、D）。NaCl 溶液浓度过高或过低时，马铃薯直链淀粉聚集体均未充分生长。马铃薯直链淀粉聚集体由其分子双螺旋堆积而成。NaCl 诱导的马铃薯直链淀粉自聚集行为主要由Na+与淀粉分子链上的羟基和带负电的磷酸基团之间的静电作用来调控。在NaCl 溶液中，Na+与淀粉分子链上带负电的磷酸基团间的静电作用可以屏蔽淀粉分子内部的静电斥力，有利于形成稳定的双螺旋结构，进而堆积成结构更为致密的有序的淀粉聚集体[14]。由于盐的静电屏蔽作用，KCl 对聚核苷酸的螺旋结构及晶体结构产生了类似的影响[19-20]。另一方面，Na+也会通过静电作用与马铃薯直链淀粉分子链上的羟基结合，破坏部分淀粉分子内和分子间氢键[14]，与红外光谱的试验结果相一致。氢键的破坏也会干扰马铃薯直链淀粉分子聚集过程中双螺旋的重新排布。因此，随NaCl 溶液浓度增大，Na+与马铃薯直链淀粉分子链上的磷酸基团间的静电作用增强，对淀粉分子内部静电斥力的屏蔽作用增强，有利于淀粉分子双螺旋堆积成有序的聚集体。当NaCl 溶液浓度过高时（在本试验浓度范围内，最佳浓度为0.1 mol/L），Na+与淀粉羟基的静电作用过强，对淀粉分子内和分子间氢键的破坏作用过强，不利于淀粉分子双螺旋进一步堆积成有序的聚集体。因此，马铃薯直链淀粉在0.1 mol/L NaCl 溶液中晶体生长速度最快，作用4 h 后结晶形貌基本不变。

2.2 温度对马铃薯直链淀粉自聚集行为的影响

4 ℃下马铃薯直链淀粉与0.1 mol/L NaCl 溶液作用不同时间的红外谱图见图7。

4 ℃下马铃薯直链淀粉红外谱图上，与马铃薯直链淀粉的有序结构/结晶区有关的特征吸收峰（1 046 cm-1附近）、羟基的伸缩振动峰（3 425 cm-1附近）和水分子中羟基的弯曲振动峰（1 646 cm-1附近）的强度普遍比原淀粉强，测试结果与室温（25 ℃）下马铃薯直链淀粉红外谱图（图3）类似，只是特征峰的位置发生了一定程度的移动。随着温度的降低，马铃薯直链淀粉分子的链段运动减慢，Na+-淀粉间的静电作用发生一定程度的改变，因此，与室温（25 ℃）相比，4 ℃下马铃薯直链淀粉红外谱图上与有序结构相关的特征吸收峰，以及羟基伸缩振动峰和水分子中羟基弯曲振动峰的位置发生一定程度的移动。红外测试结果表明，4 ℃下NaCl 的存在破坏了部分马铃薯直链淀粉分子内及分子间氢键，也在一定程度上影响了马铃薯直链淀粉-水分子之间的相互作用，可以诱导马铃薯直链淀粉分子重排，形成有序的淀粉聚集体。

图7 4 ℃下马铃薯直链淀粉与0.1 mol/L NaCl 溶液作用不同时间的红外光谱图Fig.7 FTIR spectra of potato amylose crystallites treated with 0.1 mol/L NaCl for different time at 4 ℃

4 ℃下，与 0.1 mol/L NaCl 溶液（pH 6.5）分别作用15 min、0.5、1、2、4、6、12、24 h 后马铃薯直链淀粉的结晶形貌见图8。

图8 4 ℃下马铃薯直链淀粉与0.1 mol/L NaCl 溶液作用不同时间的荧光倒置显微镜图片Fig.8 Representative optical micrographs of potato amylose crystallites treated with 0.1 mol/L NaCl for different time at 4 ℃

与室温（25 ℃）（图3）相比，马铃薯直链淀粉在4 ℃下的晶体生长速度明显减慢。与0.1 mol/L NaCl 溶液作用6 h 后，可以观察到高度有序、中间有十字、长绳状聚集体垂直于晶体生长的长轴方向平行堆积的大的规则聚集体，但是长绳状聚集体的末端连接有小的树状聚集体（图8 F2）。与0.1 mol/L NaCl 溶液作用24 h 以后，马铃薯直链淀粉的结晶形貌基本不变。这是因为随着温度的降低，马铃薯直链淀粉分子链段运动减慢，Na+-淀粉间的静电作用对淀粉分子双螺旋重排形成高度有序的聚集体的促进作用降低，晶体生长速度减慢。

2.3 pH值对马铃薯直链淀粉自聚集行为的影响

室温（25 ℃）下，马铃薯直链淀粉与不同pH 值的0.1 mol/L NaCl 溶液作用不同时间的红外谱见图9。

图9 室温（25 ℃）下马铃薯直链淀粉与不同pH 值的0.1 mol/L NaCl 溶液作用不同时间的红外光谱图Fig.9 FTIR spectra of potato amylose crystallites treated with 0.1 mol/L NaCl at different pH values for different time at room temperature（25 ℃）

室温（25 ℃）pH 5（图 9 A）和 pH 8（图 9 B）条件下，与原淀粉相比，与马铃薯直链淀粉有序结构/结晶区有关的特征吸收峰、羟基的伸缩振动峰和水分子中羟基的弯曲振动峰的强度普遍增强。pH 值改变，上述特征峰的位置发生一定程度的移动。在pH 5 下，马铃薯直链淀粉分子链上的羟基发生一定程度的质子化，其与Na+间的静电引力作用减弱。pH 值升至8 时，在弱碱性条件下，马铃薯直链淀粉分子链上的羟基会部分解离带负电，其与Na+间的静电引力作用增强。pH 值的改变，导致马铃薯直链淀粉分子链上的羟基与Na+间的静电引力作用发生改变，因此，红外谱图上上述特征峰的位置会发生一定程度的移动。红外测试结果说明，pH 值的改变使得NaCl 对马铃薯直链淀粉分子内及分子间氢键的破坏程度，以及对马铃薯直链淀粉-水分子之间的相互作用的影响不同，在一定程度上证实了pH 值的改变会影响NaCl 诱导的马铃薯直链淀自聚集行为。

室温（25 ℃）下，与不同 pH 值的 0.1 mol/L NaCl 溶液分别作用 15 min、0.5、1、2、4、6、12、24 h 后马铃薯直链淀粉的结晶形貌见图10（pH 5）和图 11（pH 8）。

随着NaCl 溶液的pH 值从5 升高到8，马铃薯直链淀粉晶体生长的速度加快。pH 5 条件下，与0.1 mol/L NaCl 溶液作用6 h 以后，马铃薯直链淀粉的结晶形貌基本不变（图 10 F1、F2）。pH 值升至 6.5 和 8 时，马铃薯直链淀粉的结晶形貌基本不变需要的作用时间分别缩短至 4 h（图3 E1、E2）和 0.5 h（图 11 B1、B2）。在pH 5 下，马铃薯直链淀粉分子链上的羟基发生部分质子化，其与Na+间的静电引力作用减弱，对淀粉分子间和分子内的氢键破坏作用减弱；同时，质子化的羟基也会屏蔽一部分磷酸基团带来的淀粉分子内静电斥力，有利于形成稳定的淀粉双螺旋结构。相反，pH 值升高至弱碱性时，马铃薯直链淀粉分子链上的羟基发生部分脱质子化而带负电，其与Na+间的静电引力作用增强，对淀粉分子间和分子内的氢键破坏作用增强；同时，脱质子化的羟基也增强淀粉分子内静电斥力，不利于形成稳定的淀粉双螺旋结构。但是，随pH 值升高，马铃薯直链淀粉晶体生长的速度反而加快。原因可能是，随NaCl 溶液的pH 值升高，马铃薯直链淀粉自聚集过程中淀粉-水分子相互作用发生改变，更易形成结构有序的聚集体。

3 结论

NaCl 的存在可以诱导马铃薯直链淀粉分子双螺旋重新排布，最终形成高度有序、中间呈明显十字、长绳状聚集体垂直于晶体生长的长轴方向平行堆积的大的规则聚集体。马铃薯直链淀粉在NaCl 溶液中发生自聚集的主要推动力为Na+与淀粉分子链上带负电的磷酸基团和自由羟基之间的静电作用。这种静电作用会降低淀粉分子链内部的静电斥力，也会破坏部分淀粉分子内和分子间氢键，还会影响淀粉自聚集过程中淀粉-水分子间的相互作用。

图10 室温（25 ℃）下马铃薯直链淀粉与0.1 mol/L NaCl 溶液（pH 5）作用不同时间的荧光倒置显微镜图片Fig.10 Representative optical micrographs of potato amylose crystallites treated with 0.1 mol/L NaCl（pH 5）for different time at room temperature（25 ℃）

图11 室温（25 ℃）下马铃薯直链淀粉与0.1 mol/L NaCl 溶液（pH 8）作用不同时间的荧光倒置显微镜图片Fig.11 Representative optical micrographs of potato amylose crystallites treated with 0.1 mol/L NaCl（pH 8）for different time at room temperature（25 ℃）

NaCl 溶液浓度为 0.1 mol/L 时，室温（25 ℃）下马铃薯直链淀粉分子最易形成结构有序的聚集体，作用4 h 后，其结晶形貌基本不变；浓度过高或过低，其结晶形貌基本不变所需的时间延长。降低温度，马铃薯直链淀粉分子链段运动减慢，Na+-淀粉间的静电作用对淀粉聚集的促进作用降低，晶体生长速度减慢。在pH8的弱碱性条件下，马铃薯直链淀粉分子链上的羟基发生部分脱质子化，可能导致淀粉自聚集过程中淀粉-水分子相互作用发生改变，更易形成结构有序的聚集体。