加味四君子汤对慢性阻塞性肺疾病小鼠膈肌线粒体损伤的修复作用

胡涛， 周晓芸， 薛丹， 宋雨鸿

（1.广州市第一人民医院，广东广州 510180；2.广州医科大学，广东广州 511436）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一种涉及多种器官的全身性反应，晚期极易并发骨骼肌功能障碍，而线粒体是骨骼肌运动所需能量的生成场所，也是产生活性氧的主要场所，后者可损伤线粒体，影响能量代谢进而导致骨骼肌功能障碍[1-2]。有研究[3-5]表明，健脾及健脾中药对线粒体能量代谢具有明显的调节作用，可改善骨骼肌疲劳。而加味四君子汤以健脾益气为治则，临床研究[6]表明，其可提高患者的运动量，使COPD患者的呼吸困难、生活质量得到改善，但尚无相关作用机理的研究。故本课题组通过烟熏法复制COPD小鼠模型，并给予加味四君子汤及N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）干预，从氧化应激方面探讨加味四君子汤对COPD小鼠线粒体损伤的修复作用及机理，为中医药防治COPD骨骼肌功能障碍提供科学依据，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级8周龄健康雄性SD小鼠50只，体质量（20±2）g，由广东省医学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK（粤）2018-0094。本实验得到广东省中医院实验动物伦理委员会批准。

1.2 药物及配制 加味四君子汤主要组方为党参、黄芪、茯苓各20 g，白术12 g，法半夏、甘草、五味子各6 g，虫草花10 g，上述中药材均由广州市第一人民医院药剂室提供。用回流提取法将药液浓缩至剂量相当于含生药2.25 g/mL，4℃保存备用。乙酰半胱氨酸泡腾片（每片600 mg，由浙江金华康恩贝生物制药有限公司生产，批号：H20057334）由生理盐水溶解制成混悬液。

1.3 试剂 大前门牌过滤嘴香烟（20支/包，烟气烟碱量0.8 mg/支，焦油量11 mg/支，烟气一氧化碳量13 mg/支，由上海烟草集团有限责任公司出品）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、琥珀酸脱氢酶（SDH）测定试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.4 仪器 自制熏烟染毒箱：70cm×50cm×40cm，145 L，每侧各有1.5 cm×1.5 cm小孔；光学显微镜（日本奥林巴斯公司）；Allegra X-22台式低速离心机（美国Beckman公司）；NanoDrop 2000C超微量紫外/可见分光光度计（美国Thermo公司）；透射电镜（日本日立电镜有限公司）。

1.5 COPD模型复制及药物干预 50只小鼠在SPF级动物实验室适应性饲养3 d后，采用随机法将小鼠分为5组，参照宋一平等[7]的方法复制小鼠COPD模型。除正常组小鼠，所有小鼠置入自制熏烟染毒箱，每天2批次予以被动吸烟，每批次8支大前门香烟，分2次给予，每次持续30 min，2次熏烟间隔时间大于4 h，持续8周。熏烟完毕将动物放回原饲养笼中正常进食进水。熏烟4周后，在熏烟前给予药物干预，中药高、低剂量组给予加味四君子汤（剂量分别为20、10 g·kg-1·d-1）灌胃，NAC组给予NAC泡腾片混悬液（剂量为100 mg·kg-1·d-1）灌胃，共4周。正常组及模型组给予等体积生理盐水灌胃。

1.6 观察指标与方法

1.6.1 一般状况 每日观察各组小鼠的精神状态、呼吸、摄食量、大便性状、毛发光泽及体质量变化等。

1.6.2 肺组织病理形态学 给药结束后处死小鼠，取其左肺上叶，以体积分数10%福尔马林溶液固定、梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、切片和苏木素—伊红（HE）染色处理，于显微镜下观察各组小鼠肺组织病理改变。

1.6.3 膈肌超微结构 将经过体积分数4%戊二醛固定的1 mm3膈肌漂洗，20 g/L四氧化锇固定2 h，再漂洗，丙酮梯度脱水，包埋，聚合，超薄切片（厚0.1 μm），醋酸铀—枸橼酸铅电子染色。应用透射电镜观察各组膈肌超微结构变化。

1.6.4 膈肌SOD活性、MDA含量及SDH活性 称取2 g膈肌，加入匀浆液在冰浴下匀浆（3 000 r/min），取上清分装，置于-20℃冰箱保存。用比色法在分光光度计上进行膈肌SOD活性、MDA及SDH活性含量检测，方法按试剂盒说明操作。

1.7 统计方法 采用SPSS 19.0统计软件进行数据处理，所有数据均以均数±标准差（）表示，组间均数比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠一般状况比较 各组小鼠熏烟初喜聚集成堆，久则出现流涎、点头呼吸、喘息等症状并伴有体质量增长缓慢趋势。模型组呼吸加深加快症状呈进行性加重，并出现精神萎靡，口鼻分泌物增多，喉中痰鸣，皮毛黄涩，消瘦，大便稀软，饮食及摄水量减少，体质量下降明显。而各药物干预组小鼠一般状况较模型组有所改善。

2.2 各组小鼠肺组织病理形态学比较 图1结果显示：正常组小鼠肺泡结构正常，小支气管未见炎症反应，肺泡壁完整；模型组小鼠部分区域肺泡上皮增生，肺泡间隔增厚，肺泡壁变薄，肺泡腔明显扩大，部分肺泡融合形成肺大泡，与正常组比较有显著差异；与模型组比较，中药高、低剂量组及NAC组小鼠大部分肺泡相对完整，但仍有部分肺泡腔扩大，部分肺泡腔融合，程度较模型组轻。

2.3 各组小鼠膈肌超微结构比较 图2结果显示：正常组膈肌肌纤维排列整齐，Z带清晰，线粒体完整，细胞核完整，核膜清晰；模型组膈肌肌纤维排列絮乱、不均，细胞核完整，核膜模糊，且线粒体结构存在损伤，部分线粒体残缺、空泡化，与正常组比较有明显改变；与模型组比较，中药高、低剂量组及NAC组膈肌肌纤维排列整齐、完整，线粒体及细胞核完整，但NAC组Z带模糊。

2.4 各组膈肌组织SOD活性、MDA含量及SDH活性的比较 表1结果显示：与正常组比较，模型组SOD、SDH活性显著降低（P＜0.05），而MDA含量则升高（P＜0.05）；与模型组比较，中药高、低剂量组SOD、SDH活性显著升高（P＜0.05），MDA含量下降明显（P＜0.05）；与NAC组比较，中药高剂量组对SOD、SDH活性的升高作用及对MDA含量的降低作用更明显（P＜0.05），但低剂量组差异不明显（P＞0.05）。

图1 各组小鼠肺组织病理形态学比较（HE染色，×400）Figure 1 Comparison of the histopathologic features of lung tissues in mice of various groups（by HE staining，× 400）

图2 各组小鼠膈肌超微结构比较（透射电镜，×20 000）Figure 2 Comparison of the ultrastructural features of diaphragm in mice of various groups（under transmission electron microscope，× 20 000）

表1 各组小鼠膈肌SOD活性、MDA含量、SDH活性的比较Table 1 Comparison of SOD activity，MDA content and SDH activity in diaphragm of mice in various groups（-x± s）

3 讨论

慢性阻塞性肺疾病（COPD）晚期患者可并发营养不良和骨骼肌萎缩，影响呼吸肌和外周肌肉的肌力和耐力[8]，从而引起呼吸衰竭，增加COPD死亡率。氧化应激在COPD的发生发展中占有重要作用，吸烟产生大量的活性氧（ROS），诱导氧化应激[1]，从而损伤肺组织。本研究结果显示，模型组小鼠肺组织部分区域肺泡上皮增生，肺泡间隔增厚，肺泡壁变薄，肺泡腔明显扩大，部分肺泡融合形成肺大泡，表明符合COPD病理改变。

正常人体内存在着氧化-抗氧化的动态平衡[9]，机体内的自由基需要自由基清除酶来清除，SOD作为机体一个重要的抗氧化酶，在清除自由基方面有着重要的地位[10]。如果自由基不能完全清除，过多的自由基就会侵袭生物膜上的多元不饱和脂肪酸，而产生脂质过氧化物MDA，它的含量直接反映体内脂质过氧化反应水平的高低，间接体现机体体内细胞受到自由基侵害的严重程度[11]。本研究发现，与正常组比较，模型组小鼠膈肌SOD活性明显降低（P＜0.05），而MDA含量明显升高（P＜0.05），表明COPD模型小鼠氧自由基增多、脂质过氧化反应增强。与模型组比较，中药高、低剂量组SOD活性升高（P＜0.05），MDA含量下降（P＜0.05）；与NAC组比较，中药高剂量组SOD活性、MDA含量变化有差异（P＜0.05），但中药低剂量组差异不明显（P＞0.05）。表明加味四君子汤可通过提高SOD活性，降低MDA含量，来减轻COPD模型小鼠氧化应激反应，从而保护细胞内环境稳定，其中高剂量具有较明显的优势，且抗氧化能力优于NAC。

线粒体是体内能量产生的主要场所，骨骼肌作为主要的运动组织，需要消耗大量的能量进行伸缩活动。当体内氧自由基过多时，产生的脂质过氧化物就会影响骨骼肌线粒体的功能，如MDA就可破坏细胞膜结构并降低膜流动性[12]，不仅线粒体结构改变，还表现出线粒体功能障碍[13]，导致骨骼肌氧化损伤，引起骨骼肌疲劳[2]。本研究应用透射电镜观察小鼠膈肌组织，发现模型组小鼠膈肌肌纤维排列絮乱、不均，细胞核完整，核膜模糊，核质中异染色质较多，与正常组相比有明显改变，且线粒体结构存在损伤，可见部分线粒体残缺、空泡化，提示烟雾可导致膈肌线粒体结构改变。SDH是位于线粒体内膜上的三羧酸循环能量代谢中的一个关键酶，它的活性可直接反映线粒体功能变化，是评价线粒体氧化能力的评价指标之一。本研究发现，与正常组比较，模型组小鼠骨骼肌线粒体SDH活性明显降低（P＜0.05）。结合膈肌电镜结果，认为COPD小鼠膈肌存在着结构异常和功能障碍，使能量产生过少，致熏烟后小鼠消瘦、喜蜷卧。与模型组比较，中药高、低剂量组SDH活性升高（P＜0.05），表明加味四君子汤可提高COPD小鼠骨骼肌线粒体SDH活性，保护线粒体结构完整性，恢复能量代谢，以维持骨骼肌功能正常发挥。这可能是加味四君子汤保护COPD小鼠膈肌功能的作用机理。

加味四君子汤主要由党参、黄芪、茯苓、白术、法半夏、甘草、五味子、虫草花组成。已有研究[14]表明，四君子汤可以降低骨骼肌细胞MDA含量、增强SOD活性、改善肌细胞钙稳态等，从而恢复骨骼肌损伤。黄芪、茯苓具有提高骨骼肌肌酸磷酸肌酶（CPK）活性的功用，可以明显改善脾虚大鼠“脾主运化”的功能[15]。而NAC是一种含巯基的化合物，是左旋半胱氨酸的天然衍生物，早于1980年就被发现能够用来治疗氧化应激增加的疾病。本研究发现，与NAC相比，加味四君子汤具有更明显的减轻氧化反应，提高线粒体能量代谢的作用。

综上所述，本研究结果表明，健脾益气是治疗COPD小鼠膈肌功能障碍的基本治则，而加味四君子汤作为健脾益气代表方剂，可减少COPD小鼠体内氧自由基的损伤，减轻氧化反应，维持线粒体能量正常输出，对能量代谢的改善具有重要作用。