基于网络药理学研究三草降压汤抗糖尿病合并高血压的分子机制

杨娟，郭丽娜，王单单，王瑞

流行病学研究证实，糖尿病病人高血压的发病率显著高于非糖尿病病人，40%～50%的2型糖尿病病人患有高血压，而非糖尿病病人高血压的发病率为20%，当糖尿病合并广泛肾损害时，几乎100%患有高血压［1］。经典名方“三草降压汤”即能降低糖尿病合并高血压病人的血压，也能有效改善血糖、血脂水平，达到滋养肝阴、平抑肝阳的疗效［2］，主要有夏枯草、益母草和龙胆草组成。夏枯草是唇形科植物夏枯草（Prunella Vulgaris L.）的干燥果穗，主要含有黄酮类、酚酸类、三萜及其苷类、固醇及其苷类、挥发油等成分，具有降血糖、降血压、抗菌、抗炎、抗病毒等生物活性［3］；益母草是唇形科植物益母草［Leonurusartemisia（Lour.）S.Y.Hu］的新鲜或干燥的地上部分，主要含有生物碱类、二萜类、环形多肽类、黄酮类等成分，具有溶栓、降血脂、抑制血小板聚集、改善微循环、减少细胞内钙超载等药理作用［4］；龙胆草（Gentiana scabra Bunge.）是龙胆科龙胆属多年生草本植物条叶龙胆等的根和茎，主要含有苷类、生物碱类、黄酮类等成分，具有利尿、抗菌、抗肿瘤的药理活性。然而三草降压汤抗糖尿病合并高血压的活性成分和分子作用机制鲜有报道。因此，本研究于2019年3—5月从网络药理学的视角，采用网络拓扑分析和信号通路富集分析三草降压汤抗糖尿病合并高血压潜在的分子机制，为三草降压汤抗糖尿病合并高血压的进一步探索提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 TCMSP 中药系统药理学数据库和分析平台（http：//ibts.Hkbu.Edu/.hk/ LSP/ tcmspsearch/），CTD毒性与基因比较数据库（http：//ctdbase.org/），TTD药物靶标数据库（http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/），DrugBank生物信息学和化学信息学数据库（https：//www.drugbank.ca/），PharmGKB 遗传药理数据库（https：//www.pharmgkb.org/），DAVID 生物信息学资源数据库（https：//david.ncifcrf.gov/），String 在线分析平台（https：//string-db.org/），UniprotKB 数据库（https：//www.uniprot.org/），OmicShare在线作图软件（https：//www.omicshare.com/user/invite.php/），Cytoscape 3.7软件，软件均运行于Windows操作系统平台。使用的相关软件均为免费开源软件。

1.2 方法

1.2.1 三草降压汤活性成分及其靶点筛选 中药系统药理学数据库及分析平台TCMSP 主要预测中药及其复方化学成分的吸收、分布、代谢和排泄。基于CTD、TCMSP和中国知网数据库搜索三草降压汤相关化学成分174个，夏枯草60个，益母草51个，龙胆草63个。结合PubMed、中国知网、万方等数据库报道，根据药物代谢动力学相关参数把药物口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%和药物相似性（Drug Similarity，DL）≥0.18 作为三草降压汤活性成分筛选的条件，一般认为生物利用度越大其生物利用度越好，DL≥0.18 的分子类药性较好［5］。筛选三草降压汤中出符合条件的化合物，分别采用TCMSP 数据库和Uniprot 数据库获得符合条件化合物的作用靶点和相关靶点人的基因名称。

1.2.2 糖尿病合并高血压相关靶点检索 CTD、TTD、DrugBank 和PharmGKB 数据库是公认的疾病靶点在线数据库，能够提供基因和有关化合物相互作用的网络模型，化学成分与基因的关系以及化学成分在体内运输和积累的数据库。打开每个数据库，分别将“diabetic mellitus”“hypertension”作为检索词在数据库检索，获得与糖尿病合并高血压相关的作用靶点。

1.2.3 关键靶点筛选 分别将获得的三草降压汤的相关靶点和糖尿病合并高血压的相关靶点输入Cytoscape 3.7 软件，依次生成“成分-靶点”和“疾病-靶点”网络图，采用Cytoscape 3.7 软件的Merge 插件合并“成分-靶点”网络图和“疾病-靶点”网络图，删除重复的靶点和边，获得“成分-靶点-疾病”网络图，初步获得三草降压汤抗糖尿病合并高血压的潜在共同作用靶点。

1.2.4 共同作用靶点的相互作用研究 将三草降压汤活性成分和糖尿病合并高血压的共同作用靶点输入String 在线分析平台，选择多倍蛋白，生成“蛋白质-蛋白质”相互作用关系（Protein-Protein Interaction，PPI）网络图。PPI是寻找靶点之间相互作用关系的重要途径，能够反应蛋白质之间的相互作用关系。

1.2.5 GO 富集分析 DAVID 生物学信息数据库主要基于WEB服务器进行基因功能富集分析，是在线的功能注释系统。其主要包括分析工具和生物学知识库，可用于靶点功能、信息通路、疾病分析等。将共同作用靶点输入到DAVID数据库中，以人的基因作为背景进行GO富集分析。

1.2.6 KEGG通路富集分析 采用DAVID生物学信息数据库中的京都基因和基因组百科全书通路（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway，KEGG）分析和输入靶点有关的生物信息通路，并利用统计学方法对靶点和相关生物信息通路进行分析。可以根据P＜0.05且生物信息通路中靶点的数量为2个或2个以上为重要通路，进而重点分析。因此通过DAVID生物学信息注释数据库对三草降压汤活性成分和糖尿病合并高血压的72共同作用靶点进行KEGG 通路富集分析。分析结果以P＜0.05 且生物信息通路中靶点数量≥2的为显著的通路。

2 结果

2.1 三草降压汤活性成分筛选 通过TCMSP 数据库共获得174 个三草降压汤的已知成分，夏枯草成分有60 个，益母草成分有51 个，龙胆草成分有63个；其中OB≥30%的成分有61个，占总成分35.06%；DL≥0.18 的有113 个，占总成分64.94%。符合OB≥30%和DL≥0.18 条件化合物共有28 个，占总成分16.09%，这28个成分的口服生物利用度和类药性良好，删除4 个重复成分。此外龙胆酸和四乙酰龙胆苦苷没有检索到相关靶点。因此，本研究共纳入三草降压汤的22个成分作为候选化合物，见表1。

2.2 关键靶点分析 基于CTD、TCMSP和中国知网数据库共筛选出三草降压汤活性成分作用靶点247个。通过查找CTD在线数据库，获得糖尿病合并高血压相关的作用靶点，删除重复的靶点后，共获得731个与糖尿病合并高血压有关的靶点，此731个靶点是糖尿病相关靶点和高血压相关靶点之和。采用Cytoscape 3.7 软件构建“成分-靶点-疾病”相互作用关系网络图，直观的展现活性成分、靶点和疾病的相互作用关系，如图1 所示。图1 中圆形代表三草降压汤的化学成分，正方形代表作用靶点，三角形代表疾病，节点代表活性成分或者作用靶点，边代表活性成分和作用靶点之间的相互作用关系，节点的大小与对应成分的重要程度成正相关，节点越大该成分的重要程度越显著。分析“成分-靶点”网络图发现：槲皮素的作用靶点最多，为143 个；山柰酚、木樨草素、β-谷甾醇、花生四烯酸、半日花烷型二萜的潜在作用靶点数次之，分别为57、53、35、34、31个；7-豆甾-烯醇、豆甾醇葡萄糖苷、甜菜黄嘌呤Ⅰ的潜在作用靶点最少，均为2 个。三草降压汤活性成分和糖尿病合并高血压共同的作用靶点共有75个，如图1 中间所示，包括白细胞介素-6（IL-6）、超氧化物歧化酶1（SOD1）、肿瘤坏死因子（TNF）等。说明了中药一成分多靶点及一靶点多成分的复杂作用关系，验证了三草降压汤多成分、多靶点整体协作发挥作用的特点。

2.3 靶点相互作用关系分析 通过String数据库构建三草降压汤活性成分作用靶点和糖尿病合并高血压病共同作用靶点的PPI 网络图。除了PDE3A（磷酸二酯酶3A）、TRPM5（味觉相关蛋白）和KCNU1（T 淋巴细胞分化蛋白）以外，IL-6、SOD1、TNF等72 个共同作用靶点关系紧密，因此PDE3A 不再纳入研究。靶点之间相互作用关系见图2。

2.4 关键靶点GO 富集分析 采用DAVID 数据库的GO 富集分析功能，对三草降压汤和糖尿病合并高血压的72 个共同作用靶点进行富集分析。分析结果如图3，4 所示，共获得到318 个GO 条目，其中包括细胞凋亡、细胞代谢、免疫应答、细胞转运、细胞增殖、炎症反应等243条生物过程（Biological Process，BP），细胞结合、受体结合、转录因子活性、细胞因子活性、脂质结合、蛋白结合等33 条分子功能（Molecular Function，MF），细胞间隙、细胞膜、细胞质基质、细胞表面、细胞质膜、细胞质、细胞器膜等42 条细胞组成（Cell Component，CC）。说明72 个共同作用靶点参与细胞的组成并影响细胞的功能，调控其中一个或多个作用靶点就可以影响相应疾病发生和发展。

表1 三草降压汤主要活性成分

图1 三草降压汤抗糖尿病合并高血压“成分-靶点-疾病”相互作用网络图析：A为生物过程，B为分子功能，C为细胞组成

图2 三草降压汤活性成分共同作用靶点相互作用分析

图3 三草降压汤抗糖尿病合并高血压共同作用靶点GO高集分析各组分所占比例

图4 三草降压汤抗糖尿病合并高血压共同作用靶点GO富集分

2.5 关键靶点KEGG 通路富集分析 采用DAVID在线数据库对三草降压汤和糖尿病合并高血压的相同靶点进行信号通路注释，得到靶点参与的所有信号通路36条。信号通路以P＜0.05且通路中靶点的个数≥3 个的为显著通路。共富集得到21 条显著通路，主要包括癌症信号通路、细胞凋亡、细胞因子受体相互作用、脂肪因子信号通路、小细胞肺癌、T细胞受体信号通路、丝裂原活化蛋白激酶信号通路、Toll 样受体信号通路等。癌症信号通路中有23个作用靶点，基因在细胞因子受体相互作用有12个作用靶点，信号通路包含关键靶点个数如表2所示。一个基因参与多条信号通路，如图5所示，八边形代表信号通路，菱形代表参与信号通路的靶点，节点的大小越大则该节点越重要，边代表两个节点之间的联系。表明这些通路之间相互影响，参与机体的炎症反应、免疫应答、信号转导等过程，影响细胞的增殖、分化、代谢、凋亡等多种生物学功能。

图5 三草降压汤抗糖尿病合并高血压“信号通路-靶点”网络图

3 讨论

中医认为糖尿病属于“消渴病”的范畴，饮食不节、过食辛辣厚味的食物均能够导致脾胃湿热内生、胃肠结热、热邪伤阴，最后演变成“消渴病”［6］。糖尿病的发病机制比较复杂，主要有血流动力学改变、氧化应激反应、炎症反应、细胞凋亡、细胞增殖、多通路激活等多个方面，如长期高糖刺激下，糖基化终产物增多，从而激活蛋白激酶C（PKC）、核因子κB（NF-κB）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）等一系列相关信号通路，进一步激活转化生长因子-β（TGF-β）等信号通路，促进细胞外基质的合成［7］。研究报道，细胞核核内荷尔蒙受体（PPARs）属于核受体家族的亚族，通过与相应配体结合调节基因表达，在肥胖、胰岛素抵抗、冠心病等代谢性疾病的发生及发展中具有重要作用。据流行病学研究报道，C 反应蛋白（CRP）和高血压等心血管疾病的发生和发展有着密切关系，认为他是一个被低估而未利用的心血管病的危险因子［8］。糖尿病病人持续的高血糖将刺激IL-6分泌增加，从而导致大量的CRP产生。中医药在治疗糖尿病及其并发症等慢性疾病方面具有独特的优势。三草降压汤既能有效改善血糖又能调节血压，对糖尿病合并高血压具有较好的治疗作用。发现三草降压汤中化学成分显著程度较显著的有槲皮素、山柰酚、木樨草素、β-谷甾醇、花生四烯酸、半日花烷型二萜等。目前已经有研究发现槲皮素是一种具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、降糖降压、保护心血管、清除自由基等多种生物活性的多羟基黄酮类化合物［9-10］；山柰酚是具有抗氧化、抗肿瘤、抗骨质疏松、降血糖、调节免疫等多种生物活性的黄酮醇类化合物［11］；木樨草素属于四羟基黄酮类化合物，是天然黄酮类化合物的代表性成分，具有抗肿瘤、抗炎、降血压、舒张血管、抗动脉粥样硬化、抗菌抗病毒等多种药理活性［12-13］；花生四烯酸是一种重要的人体必需脂肪酸，具有促进脑生长发育、舒张血管、参与造血、调节免疫、抗炎、调节神经内分泌等生物学功能［14-17］。

表2 三草降压汤抗糖尿病合并高血压21条显著信号通路

本研究获得三草降压汤抗糖尿病合并高血压的72 个靶点，其中肿瘤抑制蛋白（TP53）、细胞核因子κB p65蛋白（RELA）、表皮生长因子受体（EGFR）、血管内皮生长因子（VEGFA）、白细胞介素-1B（IL-1B）、糖原合成酶激酶（GSK3B）、TNF、B细胞淋巴瘤/白血病-2基因（BCL2）在网络图中的显著性比较大，预测可能是三草降压汤抗糖尿病合并高血压的关键靶点。关键靶点参与2型糖尿病、小细胞肺癌、癌症信号通路、脂肪细胞因子信号通路、T细胞受体信号通路、Toll样受体信号通路、丝裂原活化蛋白激酶信号通路等21条通路。其中2型糖尿病、脂肪细胞因子信号通路、癌症信号通路在网络图中的显著性较大，可能在三草降压汤抗糖尿病合并高血压中发挥重要作用。网络图中靶点之间复杂的作用关系，表明靶点之间相互作用、相互影响，最终影响疾病的发生发展。通过共同作用靶点通路富集分析发现即富集了脂肪因子信号通路等与糖尿病有关的信号通路，又富集了小细胞肺癌、癌症等多条信号通路。预示着疾病之间是相互作用、相互影响、相互关联的。

综上所述，本研究利用网络药理学系统地探讨了三草降压汤糖尿病合并高血压的复杂分子网络关系，体现了三草降压汤是通过“多成分-多靶点-多途径”的整体协同发挥疗效。为深入研究三草降压汤抗糖尿病合并高血压的分子机制提供依据，也为研究三草降压汤抗糖尿病合并高血压的药效物质基础提供借鉴。