五倍子体外抑制大肠杆菌实验研究

蔡小利，付丽云，郭蔚冰，陈志强 *

(内蒙古华天制药有限公司 内蒙古赤峰 024000)

在畜禽养殖过程中，随着抗生素的大量使用，越来越多的细菌产生了耐药性，要想预防和治疗动物疾病，抗生素的使用剂量不断加大，抗生素产生的耐药性以及药物残留等相关问题也会越来越突出。在所有的细菌中，大肠杆菌产生的耐药性是非常快的，对很多的抗生素都具有耐药性，在有些养殖场已经到了不知选择何种抗生素来应对动物大肠杆菌性疾病。随着限抗令的颁布和实施，养殖业需要无抗低毒的抗生素替代品显得愈加迫切。中药在我国已经应用了几千年，积累了大量的临床资料，国内的很多学者或者企业越来越重视如何从中药中筛选出抗菌药物[1]。药理学研究发现，五倍子含有鞣质、黄酮、蒽醌、没食子酸等物质，有效成分十分复杂，具有敛肺降火、止汗止血、抗菌解毒等多种生物学功能[2]。本实验选取五倍子水提取物进行体外抑菌实验，通过对大肠杆菌抑菌效果和最低抑菌浓度的测定，筛选出应用于临床治疗的中药浓度。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 五倍子购自内蒙古通辽某中药店。

1.1.2 受试菌种由内蒙古通辽市某腹泻犊牛粪便分离鉴定，由内蒙古民族大学动科院微生物实验室保存。

1.1.3 培养基营养琼脂培养基、蛋白胨、酵母提取物购自青岛海博。

1.2 实验方法

1.2.1 中药水提取物的制备 分别称取一定量的中药原药材，用中药粉碎机粉碎后过40 目筛，称取20 g，加蒸馏水200 mL，用中药煎药器煎煮1h，倒出上清，再重新加水200mL继续煎煮1h，取上清液和第一次合并，离心过滤补足蒸馏水最终为200mL，成原液浓度1 g/mL，用无菌滤器过滤药液，4℃冰箱保存备用。

1.2.2 菌液的准备 将大肠杆菌接种于5mL LB 液体培养基，37℃培养24 h，取0.1 mL 于普通琼脂平板上培养12 h，用灭菌生理盐水洗下菌落并稀释，血细胞计数板估测活菌数后稀释至1.0×109cfu/mL，即为实验菌液。

1.2.3 中药提取物抑菌作用的测定实验采用平皿打孔法[3]，吸取0.1mL 实验菌悬液，涂布于琼脂平板表面，用6mm 打孔器在平板上均匀打孔，在孔内滴加0.1mL 五倍子提取物，置37℃培养24 h 后测定抑菌直径。重复实验3 次。

1.2.4 最小抑菌浓度MIC 的测定采用微量细胞培养板倍比稀释法，取无菌的96 孔细胞培养板，从左至右依次标记为1-12 号，于每孔加入肉汤培养液0.1mL，1 号孔加入上述制备的药物0.1mL，2～10 号孔10 级倍比稀释，11 号孔不加菌液，其余各孔加上述制备的菌悬液2.0μ L，使各孔的药物最终浓度为：500、250、125、62.5、31.25、15.62、7.81、3.91、1.95 和0.98 mg/mL 共10 个浓度梯度，12 号孔加不含药物的基质培养液作阴性对照，充分震荡混匀后37℃培养24 h，观察细菌生长情况，判断无浑浊试管的最小浓度即判定为MIC。每个浓度设三个平行孔。

2 结果

2.1 中药提取物体外抑菌圈直径的测定结果

测定结果显示五倍子抑菌圈直径为12.6mm，五倍子水提取物有显著地抑菌效果。（判断标准［4］：大于10 mm 为强抑制，8～10 mm 为抑制，小于8 mm 以下弱抑制）

2.2 中药提取物最低抑菌浓度的测定结果

采用倍比稀释法对中药水提取物进行MIC 的测定。结果表明五倍子水提取物的MIC 为15.625 mg/mL，结果见表1。

表1 五倍子水提取物对大肠杆菌的MIC测定

3 讨论

中药在我国种类非常多，各种药物合理配伍，不良反应很少，对人和动物的副作用比较小，价格表较便宜，不会产生耐药性的问题，不会产生药物残留，对环境不会形成污染，在目前减抗令颁布实施后成为临床用药的首选，得到国内外学者的高度重视。中药的抗菌作用主要是通过调理患者的功能状态，而西药则侧重于药物与微生物之间的相互作用得以实现。本实验选用水煎煮方法对五倍子进行提取分析，选用临床致病分离的大肠杆菌作为研究对象，结果表明，五倍子水提物有显著的抑菌效果，其最低抑菌浓度为15.625 mg/mL。中药水提法临床使用方便，不需要特殊的仪器设备，更便于基层推广使用。

本实验选择了临床分离的致病菌，将致病菌与药物直接接触，没有动物实验，因此不能证实药物在体内的功效，所以选择中药时既要考虑药物的体外抑菌实验结果，还要综合考虑中药在体内的效果，这样才能使中药发挥真正的功效。