三波长吸收光谱法测定药物中地奥司明
2020-03-20张淑琼
张淑琼 江 虹 刘 艳 向 容 李 琴
(长江师范学院化学化工学院，长江师范学院武陵山片区绿色发展协同创新中心重庆 408100)
地奥司明(Diosmin)是一种血管保护剂，它具有增强静脉张力、改善微循环及促进淋巴回流等作用，临床上主要用于治疗慢性静脉功能不全、淋巴功能不全、急性痔发作、糖尿病患者的微血管病变和继发于传统肺癌治疗后的上肢淋巴水肿等。该药的副作用：在神经系统方面有失眠、嗜睡、眩晕、头痛、焦虑和疲劳等；在胃肠道方面主要有恶心、呕吐、消化不良、腹痛及腹泻等；在皮肤方面主要有湿疹及玫瑰糠疹等。鉴于此，为了控制用药质量，对药物中地奥司明含量的检测方法进行研究显得很有必要。目前，文献报道的对地奥司明的检测方法并不多，主要是高效液相色谱法[1-8]和液-质联用法[9，10]，也偶有气-质联用法[11]、电化学法[12]及荧光法[13]等的报道。高效液相色谱法和液-质联用法有高的准确度和灵敏度，但仪器价格贵、成本高，不易普及，并且前处理麻烦、费时。吸收光谱法不仅操作简便、仪器价廉易于普及，并有较高灵敏度，且目前未见用吸收光谱法研究地奥司明的报道。
本工作以亮绿作为地奥司明的缔合剂，用三波长吸收光谱法来研究地奥司明的定量测定方法。实验表明，地奥司明在一定浓度范围内服从比尔定律，灵敏度比单波长法高2～3 倍，比一般吸收光谱法(表观摩尔吸光系数为103或104L/(mol·cm))高1或2 个数量级。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
U-4100型紫外-可见-近红外分光光度计，日本日立公司；pHS-3C型精密酸度计，上海虹益仪器仪表有限公司。
亮绿(Brilliant Green，BLG；99%，成都市科龙化工试剂厂)溶液：1.0×10-3mol/L。地奥司明(Diosmin，DOSM；对照品批号：D485200，中国食品药品检定研究院)标准溶液：称取适量DOSM 对照品于小烧杯中，加6 mL 2.0 mol/L NaOH 溶液，加水10 mL，搅拌，待溶解完全后转入100 mL容量瓶中，用水定容，即得浓度为608.0 mg/L 贮备液，保存于冰箱(4 ℃)中，用时取贮备液用水稀释10 倍。Tris-HCl缓冲溶液：取适量HCl(0.10 mol/L)和适量三羟甲基氨基甲烷，0.20 mol/L(Tris)混合，用pH 计测定，配成pH=3.5～8.5范围的溶液。实验所用水为二次蒸馏水。
样品：不同生产厂家的地奥司明片(1#、2#)，市售。
1.2 样液制备
取市售地奥司明片(1#和2#)各5片，去包衣后，置于小烧杯中，加20 mL 2.0 mol/L NaOH 溶液溶解，再加20 mL水，搅拌、过滤后，将滤液置于1 000 mL 容量瓶中，用水定容。移取该溶液10.0 mL 于另一1 000 mL 容量瓶中，用水定容，即为待测液。
1.3 吸光度的测定
于10 mL 比色管中，准确加入Tris-HCl缓冲溶液(pH=5.68)1.0 mL，亮绿(1.0×10-3mol/L)溶液2.0 mL 和地奥司明(60.80 mg/L)标准溶液0～2.0 mL，用水稀至刻度，摇匀，10 min 后，在U-4100 型光度计上，以试剂空白作参比，扫描吸收光谱，分别记录424 nm、560 nm 及660 nm 处的吸光度A，再用三波长法求体系溶液的吸光度A424+560+660。
2 结果与讨论
2.1 吸收光谱
图1 亮绿与地奥司明的吸收光谱Fig.1 Absorption spectra of brilliant green and diosmin 1.6.08 mg/L DOSM,against water;2.2.0×10-5 mol/L BLG,pH=5.68,against water;3-6.3.04,6.08,9.13,12.2 mg/L DOSM-2.00×10-4 mol/L BLG,pH=5.68.
图1表明，DOSM 溶液在可见光区几乎无吸收，在紫外光区有一定吸收，最大吸收波长位于375 nm。BLG 的弱酸性溶液(pH=5.68)在可见光区有强吸收，最大吸收波长为623 nm。当在BLG 的弱酸性溶液(pH=5.68)中加入不同质量浓度的DOSM 溶液后，在可见光区的光谱曲线上出现3 个较强的强度相近的负吸收峰，分别位于424 nm(紫移199 nm)、560 nm(蓝移63 nm)和660 nm(红移37 nm)，在此3 个波长处，随着DOSM 质量浓度的增大，负吸收随之呈线性增强。表明DOSM 与BLG 间可以发生反应，生成的新物质(BLG 是一种碱性染料，DOSM 结构上的酚基氢离去后以阴离子形式存在于溶液中，于是二者以静电引力结合生成离子缔合物)在424 nm、560 nm 及660 nm 处的吸光度绝对值|A|均与加入的一定浓度范围内的DOSM 的质量浓度呈线性关系，并服从比尔定律。为了提高方法的灵敏度，采用三波长法来测定DOSM 的含量，根据吸光度的加和性，三波长法仍服从比尔定律，可用于定量分析，且灵敏度比单波长法高2～3倍。故实验选用三波长法进行测定。
2.2 适宜条件的选择
2.2.1 酸度及用量取DOSM(60.80 mg/L)标准溶液1.0 mL，BLG(1.0×10-3mol/L)溶液2.0 mL，考察Tris-HCl缓冲溶液pH值(pH=3.5～8.5)对DOSM-BLG体系灵敏度的影响。结果表明，无论用单波长法还是用双波长法或三波长法测定，最佳酸度均为pH=5.68，见图2。当酸度大于或小于pH=5.68时，|A|均有不同程度降低。故实验选择pH=5.68控制反应的酸度。随即考察了其用量对DOSM-BLG体系灵敏度的影响，结果表明用量为1.0 mL时，各测定波长下体系的|A|相对较高，即灵敏度较高；从图可知，三波长法的灵敏度相对最高。适宜酸度条件控制为1.0 mL pH=5.68的Tris-HCl 溶液。
2.2.2 BLG溶液浓度固定DOSM溶液的浓度和用量，在选定的缓冲溶液适宜酸度及用量条件下，考察BLG溶液浓度对DOSM-BLG体系灵敏度的影响。结果表明，BLG溶液的最佳浓度为2.0×10-4mol/L，见图3。故实验选择BLG(1.0×10-3mol/L)溶液2.0 mL。
2.2.3 试剂加入顺序固定DOSM溶液的浓度和用量，在选定的最佳缓冲溶液酸度、用量及最佳BLG浓度的条件下，考察试剂加入顺序对DOSM-BLG体系灵敏度的影响。结果表明，用三波长法测定，试剂加入顺序对|A|均无明显影响，即改变试剂加入顺序，体系的|A|基本不变。
2.2.4 反应速度及缔合物的稳定性考察反应时间对DOSM-BLG体系灵敏度的影响。结果表明，反应在10 min内可以进行完全。10 min后，随着反应的继续进行，|A|基本不变，稳定时间约1 h。故实验选在10 min后进行测定。
2.3 吸光度与DOSM浓度的关系
无论用单波长法还是用双波长法或三波长法测定最佳条件下的DOSM标准系列溶液，方法的线性范围均为0.03～12.2 mg/L，标准曲线见图4，其他相关参数见表1。可见，三波长法的灵敏度相对最高。
图3 BLG溶液浓度对|A|的影响Fig.3 Effect of BLG concentration on |A|1.424 nm;2.560 nm;3.660 nm;4.(424+560) nm;5.(424+560+660) nm.
图4 标准曲线Fig.4 Calibration curves1.424 nm;2.560 nm;3.660 nm;4.(424+560) nm;5.(424+560+660) nm.
表1 标准曲线相关参数Table 1 Related parameters of standard curves
2.4 共存物质的影响
2.5 样品分析
在最佳实验条件下测定各试液的吸光度，各样品平行测定5份。加标回收试验中，做3个不同加标水平的回收试验，各水平做平行试验5份。结果见表2。
表2 样品分析结果及回收试验(n=5)Table 2 Analytical results of samples and recovery tests(n=5)
3 结论
采用三波长吸收光谱法测定药物中的地奥司明，方法具有简便、灵敏度高(和一般吸收光谱法相比)、前处理简单(相对于国家标准方法[1])、费时少、所用仪器价廉及易于普及等优点。有较高的准确度(回收率为98.1%～102%)和精密度(相对标准偏差为2.0%～2.4%)，满足痕量分析要求，方法的选择性良好。该方法适用于市售地奥司明片剂中地奥司明的定量分析。
