西地那非通过上调电压依赖性钾通道抗低氧刺激的人肺动脉平滑肌细胞增殖

毛 婷,张京春,王跃秀,乔 羽,刘 蓓,张 珊

(中国中医科学院1.西苑医院心血管科、2.心血管病研究所，北京 100091；3.首都医科大学基础医学院生理学教研室，北京 100069)

低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension，HPH)与肺血管重构密切相关，特别是肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)增殖异常导致的肺动脉管壁中膜增厚，管腔狭窄。电压依赖性钾通道(voltage-dependent potassium channels，Kv)活性与肺动脉高压、肺血管平滑肌细胞增殖所致肺血管重构密切相关[1]。低氧引起PASMCs的氧敏感性Kv通道活性和表达降低，PASMCs过度增殖进而肺血管重构[2,3]。近来，西地那非为一种选择性的磷酸二酯酶V(phosphodiesterase 5，PDE5)抑制剂被用来治疗肺动脉高压，其机制主要涉及肺动脉高压时肺血管平滑肌细胞的PDE5表达和活性大大增加，西地那非可通过选择性抑制PDE5活性，增加PASMCs内的环鸟苷一磷酸(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)水平，进而激活环鸟甘酸依赖性蛋白激酶(cGMP-dependent protein kinase，PKG)，扩张肺动脉，抑制肺血管平滑肌细胞增殖以改善肺血管重构及肺血流动力学。而西地那非能否通过Kv通道影响低氧刺激的PASMCs增殖尚未见研究报道。慢性低氧抑制Kv通道尤其是Kv1.5通道功能是PASMCs增殖异常的关键机制。探索西地那非抗低氧刺激的PASMCs增殖以减轻肺血管重构与Kv1.5通道及PKG的关系是本研究的主要目的。

1 材料与方法

1.1 实验细胞株及培养基原代人PASMCs、平滑肌细胞基础培养基(smooth muscle cell basic medium，SMBM)和平滑肌细胞生长补充物(smooth muscle growth supplement，SMGS)均购自美国Cascade Biologics公司，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购于美国Gibcobrl公司。

1.2 试剂及仪器西地那非(纯品)购于美国辉瑞公司；PKG抑制剂KT-5823购于德国Merck公司；兔抗人Kv1.5抗体(APC-150)购于以色列Alomone公司；羊抗兔二抗(C50331)购于美国LI-COR公司，兔抗人Ki67抗体(ab15580)购于英国Abcam公司；脂质体2000(Lipo2000)(1168000)购于美国Invitrogen公司；Kv1.5基因的小分子干扰RNA片断(siRNA)序列如Tab 1所示，剂型为冻干粉，合成于美国ThermoFisher公司。膜片钳放大器(德国HEKA EPC10)；倒置显微镜(TE2000-U，日本Nikon)；三维显微操作仪(美国Sutter MP285)；数据采集软件(美国Patchmaster 2.0)；数据分析软件(美国Origin 8.0)；电极拉制仪(日本Narishige Model PC-10)；玻璃电极毛坯(美国Sutter BF150-110-10型)。

Tab 1 siRNA sequence

1.3 细胞培养分组与干预方法取第4～6代细胞用于实验，将细胞在平滑肌细胞完全培养基(smooth muscle growth medium，SMGM)中培养24 h后，更换成SMBM继续培养24 h，再更换成含2% FBS SMBM继续培养用于后续实验。分组如下，常氧对照组(Nor)：PASMCs于常氧孵箱(21% O2)中常规培养72 h；低氧对照组(Hyp)：PASMCs于低氧孵箱(3% O2)中培养72 h；低氧+西地那非组(Hyp+Sil)：西地那非(100 nmol·L-1)干预低氧孵箱中的PASMCs 72 h；低氧+西地那非+KT-5823组(Hyp+Sil+KT-5823)：西地那非(100 nmol·L-1)与KT-5823(300 nmol·L-1)共同干预低氧孵箱中的PASMCs 72 h；低氧+西地那非+siRNA-Kv1.5组(Hyp+Sil+siRNA-Kv1.5)：用加入siRNA-Kv1.5 lipo2000混合液的培养基于常氧孵箱中培养PASMCs 6 h，再更换成含2% FBS SMBM，加入西地那非后于低氧孵箱中继续培养72 h。

1.4 实验方法

1.4.1DAPI染色法检测细胞增殖 将细胞接种于直径12 mm的圆玻片上分组培养72 h，PBS冲洗后用冷4%多聚甲醛固定细胞，再透化处理细胞后PBS冲洗。每片取200 μL DAPI液(1 μg·mL-1)于室温避光孵育细胞，PBS冲洗。将圆玻片置于荧光显微镜下观察，每张片子于高倍镜(×200)视野下随机选择4个视野，计算其细胞数目并取其均值。

1.4.2细胞免疫荧光染色法检测细胞增殖 根据实验分组将细胞接种于预先置入小玻片的六孔细胞培养板中培养72 h，D-PBS冲洗玻片，接着4%多聚甲醛室温固定玻片。然后用2%的BSA/D-PBS洗，接着用10%羊血清封闭。透化缓冲液室温孵育。抗体anti-Ki67(1 ∶100)4 ℃作用于玻片过夜，再冲洗。二抗(Alexa Fluor 594标记的兔抗人IgG，1 ∶100)于室温孵育玻片， D-PBS洗后封片。将每张玻片于荧光正置显微镜高倍镜(×200)视野下观察，随机选择5个视野计算DAPI染核细胞核数目(蓝色荧光)、Ki67阳性染色细胞数目(红色荧光)并取其均值。采用LEICA QWin Plus软件分析，以Ki67阳性细胞百分数(红色荧光细胞数目/蓝色荧光细胞核数目)代表细胞增殖程度。

1.4.3MTT法检测细胞增殖 将细胞悬液接种于96孔板，进行细胞实验分组。第一组细胞于实验当天(即d 0)加入MTT，其余组细胞于72 h后加入MTT，添加助溶剂，于摇床上混匀使甲瓒颗粒充分溶解，采用酶标仪检测波长490 nm波长处各孔光吸收值，即为甲瓒的生成量。

1.4.4Western blot法检测siRNA沉默后的Kv1.5表达 测定低氧下西地那非孵育沉默Kv1.5的细胞上的Kv1.5表达水平。提取全细胞蛋白，制备蛋白样品，取20 μL(40 μg)全细胞蛋白电泳样品，进行SDS-PAGE电泳，随后电转至PVDF 膜上，封闭液室温封闭1 h，洗膜后用一抗Kv1.5兔源性多克隆抗体(1 ∶50)于4 ℃孵育过夜，次日取出置于摇床上室温再作用1 h，漂洗膜，接着用二抗羊抗兔IgG溶液(1 ∶10 000)室温孵育1 h，漂洗后进行扫膜。将膜置于Odyssey红外荧光成像仪中进行拍照，采用ImageJ 1.38图像软件分析其荧光强度，得出目的蛋白Kv1.5与β-actin的比值，即为Kv1.5蛋白的相对表达水平。

1.4.5细胞转染与分组 转染组分为4组：① 阴性对照组(NC组)；② 空白对照组(BC组)；③ siRNA-Kv1.5组(s1组)、④ siRNA-Kv1.5组(s8组)。用带有荧光标记的阴性对照siRNA 优化转染条件，评价转染效率；Western blot 法检测干扰前后Kv1.5蛋白表达情况。用siRNA-Kv1.5 lipo 2000混合液孵育细胞6 h，更换新鲜培养基同时加入西地那非干预细胞，于低氧孵箱中培养72 h用于后续实验。

1.4.6电生理实验的溶液配制记录Kv通道电流的溶液配方：电极内液配方(mmol·L-1)：135 KCl，4 MgCl2，10 HEPES，10 EGTA，5 Na2ATP(KOH调节pH至7.2)；浴液配方(mmol·L-1)：141 NaCl，4.7 KCl，3.0 MgCl2·6H2O，10 HEPES，1 EGTA，10 Glucose(NaOH调节pH至7.4)；电极内液中高浓度的Na2ATP用于抑制ATP敏感性钾通道电流；电极内液及浴液均不含Ca2+，且添加了Ca2+螯合剂，以最大限度地抑制大电导钙激活性钾通道活性，以避免其干扰。从而所记录的基本为Kv电流[3]。以上实验均在室温下进行。

1.4.7全细胞膜片钳记录 应用膜片钳技术，检测各组间细胞的全细胞K+电流，采用Step-Kv全细胞记录模式(见Fig 1)。在倒置显微镜(TE2000-U)下选择贴壁良好、形状规则、边缘清楚、表面光滑、无收缩的细胞。在封接电阻>1 GΩ形成高阻封接的全细胞模式下，将细胞膜电位钳制在-70 mV，发放步阶脉冲电压刺激，以20 mV为步阶，从-60 mV逐步阶越至+80 mV，持续时间300 ms，记录全细胞K+电流。

1.4.8全细胞K+电流的采集及分析 全细胞K+电流信号经膜片钳放大器输入数模转换器PatchMaster EPC10(HEKA Electronikes,Lambrecht，Germany)采集后输入计算机。实验过程中通过PatchMaster 2.0软件补偿电极电容，设置放大器增益100 mV·pA-1，采样频率10 KHz，低通滤波2.9～1.0 KHz。PatchMaster 2.0软件进行采集记录，Origin 8.0(Origin Lab，Northampton，MA)和Microsoft Excel 2010软件进行数据统计分析。记录不同电压刺激下的K+通道电流，同时记录加入5 mmol·L-1TEA(K+通道阻断剂)前后K+通道电流幅值及密度。

Fig 1 Protocol of step voltage stimulation in whole-cell patch clamp recording

1.5 统计学方法采用SPSS 12.0软件对数据进行处理，实验数据计数资料以均数±标准差表示。应用Prism 5.0软件进行统计学分析及绘图，两组数据间差异用Student’s t-test。多组间资料采用One-way ANOVA方差分析，然后Student-Newman-Keuls(SNK)方法检验。

2 结果

2.1 西地那非抑制低氧刺激的PASMCs增殖MTT结果如Fig 2显示：低氧较常氧对照组可明显促进PASMCs增殖(P<0.01)。在低氧下用西地那非共孵育细胞，采用DAPI染核计数，结果如Fig 3显示：西地那非组较低氧对照组可显著减少低氧刺激的细胞DAPI染核数量(P<0.05)。细胞免疫荧光染色法检测增殖核性抗原Ki67的结果如Fig 4显示：低氧较常氧对照组可显著增加Ki67阳性染色细胞数目；西地那非组较低氧对照组可明显减少低氧下的Ki67阳性染色细胞数量(P<0.01)。以上表明西地那非能够抗低氧刺激的人PASMCs增殖。

Fig 2 Proliferation of human PASMCs

PASMCs were incubated under normoxia (Nor) and hypoxia (Hyp),respectively.**P<0.01vsNor.

Fig 3 Hypoxia-induced human PASMC proliferation inhibited by sildenafil

A: Result of DAPI staining (200×); B: Statistical result. PASMCs were incubated under normoxia (Nor),hypoxia(Hyp) or hypoxia with sildenafil treatment(Hyp+Sil),respectively.**P<0.01vsNor;#P<0.05vsHyp.

2.2 西地那非翻转了低氧刺激的PASMCs的K+通道电流尤其Kv1.5通道电流的降低接下来为了探讨西地那非抗低氧刺激的PASMCs增殖是否与K+通道电流变化相关，本研究采用膜片钳技术记录细胞K+通道基础电流。结果如Fig 5所示：低氧下的细胞K+通道基础电流较常氧对照组明显降低(P<0.01)；低氧对照组西地那非明显翻转了低氧刺激的K+通道基础电流的降低效应(P<0.05)。接着在膜片钳全细胞记录模式下采用5 mmol·L-1TEA(被认为能够阻断Kv通道)灌流细胞浴液，以观察西地那非组的K+电流，以进一步验证西地那非所增加的细胞K+电流成分是否含Kv通道电流。结果如Fig 6所示：与低氧下对照组相比，TEA抑制了西地那非所增加的K+通道电流(P<0.05)。提示西地那非翻转的主要是Kv通道电流。为了进一步观察Kv1.5是否为西地那非翻转的Kv通道电流成分，记录在电极内液中加入特异性Kv1.5抗体(1 ∶125)前后的电流值，这两组电流差值代表西地那非翻转低氧降低的Kv1.5电流(即Kv1.5抗体效应值)。结果如Fig 7所示：Kv1.5抗体透析使低氧下西地那非组的K+电流降低了28%(P<0.01)，而低氧对照组的K+电流无明显变化。

A: Result of Ki67 positive cell nuclei (200×); B:Statistical result.**P<0.01vsNor;##P<0.01vsHyp.

2.3 沉默Kv1.5基因对Kv1.5蛋白及西地那非抗低氧刺激的细胞增殖的影响利用优化好的转染条件，将两对干扰Kv1.5基因的siRNA(s1,s8)分别转染细胞。Western blot结果如Fig 8所示：s1、s8对Kv1.5蛋白的干扰效率分别是51.3%、60.2%。与对照组相比，沉默Kv1.5基因的siRNA(s1)组的低氧下西地那非干预的细胞Kv1.5蛋白表达水平明显降低(P<0.05)，s8组的Kv1.5蛋白表达水平也明显降低(P<0.01)。MTT结果如Fig 9所示：与对照组相比，siRNA(s1)组的低氧下西地那非干预的细胞活力明显增强(P<0.05)，s8组的细胞活力也明显增强(P<0.01)。以上表明沉默Kv1.5基因能够逆转西地那非对低氧刺激的细胞增殖的抑制作用。从而间接证明西地那非可能通过上调Kv1.5表达起到抗低氧刺激的细胞增殖作用。

Fig 5 Hypoxia-decreased K+ currents in human PASMCs reversed by sildenafil

A: Representative whole-cell K+currents elicited by depolarizing the cells to a series of test potentials ranging from -60 mV to +80 mV in 20mV increments from a holding potential of -70 mV in PASMC incubated under normoxia (Nor) and hypoxia(Hyp) or hypoxia with sildenafil treatment(Hyp+Sil),respectively. B: Composite current-voltage (I-V) relationship curves from PASMCs cultured in respective conditions.**P<0.01vsNor;#P<0.05vsHyp.

Fig 6 Sildenafil-increased K+ current in human PASMCs exposed to hypoxia inhibited by TEA

A:Representative whole-cell K+current trace from PASMCs pretreated with sildenafil before (Hyp+Sil) and after induced by TEA (Hyp+Sil+TEA). B: Composite current-voltage (I-V) relationship curves.*P<0.05vsHyp+Sil.

2.4 PKG抑制剂KT-5823逆转西地那非抗低氧刺激的细胞增殖细胞免疫荧光染色Ki67及MTT法检测低氧下西地那非与PKG抑制剂KT-5823共孵育对细胞增殖的影响，结果如Fig 10所示：KT-5823能够逆转西地那非抗低氧刺激的细胞增殖作用(P<0.05)。

Fig 7 K+ currents recorded from human PASMCs pretreated

**P<0.01vsBefore anti-Kv1.5 dialysis

2.5 KT-5823抑制西地那非对低氧下细胞 K+通道电流的上调作用接着为了观察KT-5823逆转西地那非抗细胞增殖作用是否与K+通道活性变化有关。在膜片钳全细胞记录模式下，我们记录了低氧下KT-5823与西地那非共孵育细胞前后的K+通道电流，结果如Fig 11所示：KT-5823部分阻断了低氧下西地那非对K+通道电流的上调作用，K+通道电流降低了34.6%(P<0.05)。以上提示，KT-5823通过阻断低氧下西地那非对K+通道电流的上调，从而逆转西地那非抗低氧刺激的细胞增殖作用。

3 讨论

肺动脉压升高和肺血管重构是HPH的主要病理生理特征。大量研究证实，低氧引起的PASMCs增殖是导致肺血管重构的重要环节之一，Kv通道异常与肺动脉高压及肺血管重构关系密切[4,5]。低氧引起PASMCs的Kv通道活性和表达降低，细胞膜发生去极化，引起胞内的Ca2+浓度增加，导致肺血管收缩、肺动脉压渐进性升高和PASMCs过度增殖甚至肺血管重构[6]。因此，通过何种途径干预和调控Kv通道成为防治肺动脉高压的热点。西地那非在临床上用来治疗肺动脉高压，它不仅能抑制肺血管收缩、扩张肺血管、降低肺动脉压力，同时也可以抑制PASMCs增殖导致的肺血管重构[7]。

Fig 8 Expression of Kv1.5 protein in human PASMCs pretreated with sildenafil under hypoxia inhibited by silencing

A: Kv1.5 protein expression after silencing Kv1.5 gene with siRNA. B: Statistical graph. NC: negative control. BC: Blank control. s1,s8: siRNA.*P<0.05,**P<0.01vsHyp+Sil

Fig 9 The inhibitory effect of sildenafil on hypoxia-stimulatedcell proliferation reversed by silencing Kv1.5 gene

Statistical result of cell viability.*P<0.05,**P<0.01vsHyp+Sil.

Fig 10 The inhibitory effect of sildenafil on hypoxia-stimulated cell proliferation reversed by

A: Statistical result of Ki67 positive cell nuclei. B: Statistical result of cell viability from PASMCs without (Hyp+Sil) or with KT-5823 (Hyp+Sil+KT-5823) treatment in the presence of sildenafil under hypoxia.**P<0.01vsHyp;#P<0.05vsHyp+Sil.

本研究发现，西地那非能抗低氧刺激的PASMCs增殖；低氧引起PASMCs的Kv通道尤其Kv1.5通道电流幅度降低；西地那非能够逆转低氧对Kv通道电流尤其Kv1.5通道电流的下调作用；根据靶基因Kv.1.5设计的siRNA(s1、s8)同时用于实验，因为这两对siRNA可互为脱靶对照，可以最大程度地避免脱靶效应的影响。经我们实验筛选得到了沉默效率较高的siRNA序列(s1、s8)，体现在细胞Kv.1.5蛋白表达水平不同，由于Kv.1.5基因及蛋白表达在低氧刺激的PASMCs细胞增殖中起着关键作用，因此s1、s8沉默靶基因Kv1.5导致西地那非干预下的低氧刺激的细胞增殖水平不同,有力地提示了西地那非抗低氧刺激的细胞增殖效应可能与Kv1.5基因及蛋白表达的上调有关。KT-5823能够逆转西地那非抗低氧刺激的细胞增殖效应，可能与KT-5823阻断低氧下西地那非对K+通道电流的上调作用有关。因此，本研究表明西地那非通过上调Kv通道亚型Kv1.5抑制低氧刺激的人PASMCs增殖，且可能与PKG通路激活有关。

Fig 11 Sildenafil-increased K+ currents of human PASMCs under hypoxia reversed by

A:Representative whole-cell K+current trace.B:Composite current-voltage(I-V) relationship curves.**P<0.01vsHyp;#P<0.05vsHyp+Sil.

近年来的研究发现低氧可通过各种信号通路引起肺血管功能和结构发生改变，其中低氧是始动的关键因素[8]。Kv作为K+通道主要亚型，被认为是PASMCs的主要氧感受器。Kv通道电流是细胞膜电位的主要组分，研究发现氧敏感性Kv通道主要包括Kv1.1、Kv1.2、Kv1.3、Kv1.5、Kv2.1等亚型，它们的表达和功能异常是引起细胞膜电位去极化，促进PASMCs增殖导致肺血管重构的重要因素之一[9]。有研究报道，Kv1.5在调控细胞膜电位及低氧性PASMCs增殖方面尤为重要[10]。存在Kv1.5基因突变的PASMCs在低氧刺激下，细胞增殖被显著抑制[11]。本研究中采用siRNA沉默Kv1.5基因后，西地那非的抗细胞增殖效应被抑制，与文献报道结论一致。低氧抑制氧敏感性Kv1.5通道表达与功能是引起PASMCs过度增殖的重要机制。低氧使Kv通道的表达与功能降低，进而细胞膜发生去极化，电压依赖性钙通道开放，导致Ca2+内流，胞内的Ca2+浓度增加，从而促进细胞有丝分裂，加快细胞进入细胞周期；另外，Ca2+还能够激活胞内的多种依赖Ca2+的信号转导蛋白，直接或间接促进细胞增殖[12]。由此证明Kv通道是调节细胞膜电位和胞内的Ca2+浓度的效应器。因此，阻断低氧抑制的Kv通道，有可能成为防治肺动脉高压的重要途径之一。

肺动脉高压时肺血管平滑肌细胞内的PDE5表达和活性明显增加，西地那非作为一种选择性PDE5抑制剂，其机制主要是通过抑制PDE5活性，显著地减少PDE5对cGMP的降解，从而升高cGMP水平，进而发挥治疗作用，其PDE5/cGMP/PKG信号通路在调节血管张力、细胞增殖等过程中起重要作用。cGMP是PASMCs内重要的第二信使，不仅能够降低胞内的Ca2+浓度，从而促进肺血管舒张，降低PASMCs增殖，而且能够促进细胞凋亡[13]。另外，一氧化氮通过激活平滑肌细胞内的可溶性鸟苷酸环化酶，催化三磷酸鸟苷转化生成cGMP，激活其下游的蛋白激酶PKG，开放K+通道，细胞膜电位发生超极化，引起电压依赖性钙通道失活，Ca2+内流减少，胞内的Ca2+水平降低[14]。此外，PKG还可通过抑制肌醇三磷酸释放或调控三磷酸肌醇受体减少胞内钙库Ca2+的释放，使平滑肌细胞内的Ca2+水平降低，从而抑制血管平滑肌收缩，同时降低PASMCs增殖[15]。

本研究发现，西地那非可能通过上调Kv通道，尤其是Kv1.5通道抑制低氧刺激的人PASMCs增殖，且可能与PKG信号通路激活有关。但无论通过何种细胞内信号转导途径，低氧终会通过改变细胞膜上的Kv通道功能，影响细胞内Ca2+水平。进一步探讨低氧刺激的Kv通道功能降低、胞内的Ca2+浓度异常升高的分子机制，找到阻断这种Ca2+异常升高途径的有效切入点，对于改善肺血管重构具有重要意义。