高强度间歇训练对武警战士T淋巴细胞稳态的影响

彭 朋，王大宁，秦永生，薄 海，孙伯贻

T淋巴细胞是免疫系统的重要组成部分，包括辅助性T(T helper，Th)和细胞毒性T(cytotoxic T lymphocytes，Tc)两个亚群，Th细胞可继续分化为Th1[主要分泌干扰素γ(interferon γ，IFN-γ)]、Th2[主要分泌白细胞介素4(interleukin-4，IL-4)]、Th17[主要分泌IL-17A]和调节性T(regulatory T，Treg)[主要分泌转化生长因子β(transforming growth factor β，TGF-β)]四个亚群。Th各亚群彼此间相互协调、相互制约并形成Th1/Th2和Th17/Treg平衡，在维持机体免疫稳态中发挥重要调控作用[1]。

当前，部队军事训练负荷(包括负荷量和负荷强度)和难度不断加大，长时间大负荷训练后感染性疾病发生率增加，即运动性免疫抑制。课题组前期研究发现，武警战士连续3 d大负荷训练后机体出现明显的免疫抑制，其机制之一可能与运动性低血睾酮与高皮质醇血症有关[2]。因此，适时监测战士的免疫功能对于避免运动性免疫抑制、过度疲劳等相关训练伤病具有重要意义。近年来，竞技与军事体育领域兴起一种省时有效的运动方式——高强度间歇训练(high-intensity interval training，HIIT)。本研究旨在探讨急性(1次)和短期(4周)HIIT对T淋巴细胞稳态平衡的影响，为科学合理安排训练以及预防运动性免疫抑制提供依据。

1 对象与方法

1.1 受试对象 选取某部队武警男性战士23名，均为第3～4年兵，年龄(23.8±2.2)岁，身高(1.73±0.06)m，体重(75.3±5.1)kg。受试者具有较高的军事素质(均为训练标兵)，身体健康，均无心血管疾病、糖尿病、慢性感染、骨骼肌肉病史及其他严重疾患病史，无常规用药史，无烟酒嗜好。

1.2 HIIT方案 参照课题组前期建立的方法[3]在400 m标准跑道进行HIIT。利用心率贮备(heart rate reserve，HRR)百分比估算靶心率以确定运动强度，靶心率的计算公式：[(220-年龄)-静态心率]×(60%～80%)+静态心率。受试者先进行10～15 min热身(慢跑和拉伸)，随后开始正式训练，即以90%～95%HRR强度快跑3 min，然后以45%～50%HRR强度慢跑3 min，共完成6组，3次/周，共4周。训练过程中佩戴遥测心率表(Polar FT1，芬兰)实时监测受试者心率以控制运动强度在靶心率范围内。

1.3 流式细胞术检测淋巴细胞亚群分型 分别于第1次HIIT(记作HIIT1)运动前(pre)、运动后即刻(p0)、运动后60 min(p60)及末次HIIT后48 h安静状态下(post)静脉取血10 ml，肝素抗凝。取100 μl抗凝血，加2 ml红细胞裂解液，与CD3-PerCPeFluor710(总T细胞)、CD4-APCeFluor780(Th细胞)、CD8-V500(Tc细胞)、CD56-FITC(NK细胞)、CD19-PE(B细胞)、CD161-FITC(Th17细胞)、CD25-PerCP-Cy5.5和CD127-PE-Cy7(Treg细胞)单克隆抗体避光孵育20 min，300 g离心5 min。用2 ml PBS缓冲液洗涤后离心5 min。美国产FACSCantoTM II型流式细胞仪检测淋巴细胞亚群分型。

1.4 T淋巴细胞体外刺激实验 利用佛波醇乙酯/离子霉素激活T细胞，通过表面受体表达和细胞因子产生检测免疫应答功能和稳态平衡。相应的抗体包括：细胞因子IFN-γ-FITC(Th1亚群)、IL-4-PE(Th2亚群)、IL-17A-PE(Th17亚群)、TGF-β-FITC(Treg亚群)，以及Treg细胞活化标志物CD39-APC、潜在相关多肽(latency-associated peptides，LAP-PE)和糖蛋白A重复序列(glycoprotein A repetitions predominant，GARP-APC)。取抗体与相应细胞亚群(见1.3)避光孵育后用流式细胞仪(FACSCantoTM Ⅱ型，美国)检测阳性细胞与阴性细胞的分群情况，以阳性细胞率(即阳性细胞数占总细胞数的百分比)代表相对表达量。用未经激活的全血作为平行对照。

2 结 果

未经佛波醇乙酯/离子霉素刺激时，T淋巴细胞稳态平衡标志物(表面受体和细胞因子)均无显著性变化。刺激实验后，不同T淋巴细胞亚群特异标志物的表达量存在差异。

2.1 Th1/Th2 HIIT1后即刻CD4+、CD8+、CD8high和CD8lowT细胞IFN-γ显著上调(P<0.05)，60 min时较运动后即刻降低(P<0.05)。HIIT1后各T淋巴细胞亚群IL-4表达量在各时间点差异均无统计学意义，4周HIIT前后各T淋巴细胞亚群IFN-γ和IL-4表达量差异亦无统计学意义(表1)。

表1 23名武警战士一次急性HIIT对Th1/Th2平衡的影响

注：pre，训练前；p0，一次HIIT后即刻；p60，一次HIIT后60 min；Post,4周训练后；与pre比较，①P<0.05，与p0比较，②P<0.05

2.2 Th17/Treg HIIT1后60 min时Treg细胞GARP、LAP和CD39表达升高(P<0.05)。4周HIIT后Treg细胞LAP表达下调(P<0.05)。本研究未检测出Th17分泌的IL-17A以及Treg分泌的TGF-β(表2)。

表2 23名武警战士一次急性HIIT对Th17/Treg平衡的影响

注：pre，训练前；p0，一次HIIT后即刻；p60，一次HIIT后60 min；Post,4周训练后；与pre比较，①P<0.05，与p0比较，②P<0.05；“-”表示未检出

3 讨 论

3.1 急性HIIT对T淋巴细胞稳态平衡的影响 研究证实，长时间(≥1 h)高强度运动抑制Th1增殖与分化[4, 5]，但短时间(≤30 min)高强度运动对Th1/Th2稳态平衡的影响却结论不一。在本研究中，HIIT1后即刻IFN-γ表达上调，IL-4并无显著性变化，提示Th1/Th2平衡向Th1漂移。HIIT1后60 min，IFN-γ和IL-4与运动前均无统计学差异，说明Th1/Th2稳态平衡在运动后1 h恢复正常。

1次急性运动能够改变Th17/Treg稳态平衡，影响效果依赖于运动强度和持续时间。Perry等[6]发现，长时间高强度训练后Treg计数下降，T细胞趋向于分化为Th17且IL-17A分泌增多。有趣的是，马拉松比赛后，血浆和尿中IL-17A出现暂时性下降[7]。令人意外的是，本研究并未检测出IL-17A和TGF-β表达，可能是健康成年人外周血中Th17和Treg细胞含量甚微，很难检测出相应的细胞因子水平。由于Treg细胞具有抑制其他免疫细胞并维持免疫稳态和免疫耐受的作用[8]，我们进一步测定Treg早期活化标志物，结果发现，GARP、LAP和CD39在HIIT1后即刻无显著性变化，60 min后均表达上调，提示HIIT对Treg功能的影响具有滞后效应。

TGF-β是Treg分泌的特异细胞因子，其作为抑制因子能够调节免疫功能、维持免疫耐受[9]。TGF-β合成后在粗面内质网经过二聚化和蛋白水解后形成无活性的潜在TGF-β(latent TGF-β)，后者由LAP与活性TGF-β以1∶1的比例以非共价键结合而成，该蛋白复合体不能与TGF-β受体结合，因此不能发挥生物学活性。当复合物离开粗面内质网后转运至细胞表面，LAP被锚定蛋白GARP识别并结合，随后LAP被蛋白酶切割并分离出有活性的TGF-β[9]。GARP在Treg静息状态下呈低表达，激活后表达迅速上调，随后潜在TGF-β分泌增加。由于潜在TGF-β与LAP结合形成复合体，故本研究并未检测出有活性的TGF-β，然而LAP的表达可间接反映潜在TGF-β的变化。HIIT1后60 min时Treg细胞CD39表达上调，提示HIIT还可通过腺苷途径介导免疫抑制。外源性ATP水解生成腺苷需要CD39参与[10]，腺苷则可抑制Th17分化并通过下调促炎性因子和趋化因子表达而减轻炎性反应[10]。

本研究结果提示，1次急性HIIT引起T细胞稳态暂时性失衡(Th1/Th2平衡向Th1漂移)，运动后恢复期Treg合成潜在TGF-β并促进ATP分解为腺苷，分别通过抑制T细胞分化和抑制炎性反应而重建T细胞稳态。

3.2 短期(4周)HIIT对T细胞稳态平衡的影响 张宏杰等[11]发现，大学生篮球运动员16周高强度集训期间，细胞免疫功能削弱，白细胞IFN-γ不变而IL-4表达上调，提示Th1/Th2平衡向Th2方向漂移。Gholamnezhad等[12]证实，Wistar大鼠11周中等强度运动后IFN-γ/IL-4比值升高，而高强度运动后则显著性下降。陶占泉等[13]发现，青年男性5周递增负荷运动训练促使Th1(IFN-γ)和Th2(IL-4)细胞因子基因表达均显著增加，但以Th1细胞因子为甚，免疫稳态平衡趋向Th1极化；规律太极拳运动上调IFN-γ/IL-4比值[14]，Treg计数及其分泌的细胞因子增加[15]。上述研究提示，规律中等强度运动能够通过改善免疫平衡协调能力进而提高免疫功能，而反复力竭性运动则导致免疫稳态失衡及免疫功能抑制。然而本研究结果显示，IFN-γ、IL-4表达量在训练前后均无统计学差异(IL-17A和TGF-β未检测到)，提示4周HIIT后T细胞稳态平衡并未发生明显改变，可能与运动时间较短(4周)以及检测方法和手段等因素与前人研究存在差异有关。

此外本研究还发现，Treg细胞LAP表达量在4周HIIT后降低，由于LAP与TGF-β结合形成潜在TGF-β，因此LAP下调可能伴随潜在TGF-β分泌减少，从而导致Treg细胞免疫抑制功能下降。Horwitz等[16]证实，IL-2信号通路调控Treg细胞的活化与增殖进而促进TGF-β分泌增多；有研究发现，6周递增负荷运动下调淋巴细胞IL-2表达[17]。据此推测，短期HIIT通过降低IL-2分泌量而下调TGF-β表达，Treg细胞LAP随之减少。上述结果提示，短期反复HIIT后Treg细胞免疫抑制能力减弱，可能是免疫系统对规律训练的适应性反应，同时也是免疫功能增强的标志之一。然而长期(>4周)HIIT对免疫稳态的影响及机制尚不得而知，需要延长运动干预周期进一步证实。

1次急性HIIT暂时性改变Th1/Th2稳态并使Th1/Th2平衡向Th1漂移，运动后恢复期具有免疫抑制作用的Treg细胞被动员，其作用可能参与了T细胞稳态的调节与重建；短期(4周)HIIT诱导Treg细胞免疫抑制能力减弱，但对T细胞稳态平衡并无显著影响。