东乡野生稻稻曲病人工接种技术研究

胡建坤,黄 蓉,李湘民,刘永锋,廖泰珍,黄瑞荣*

(1.江西省农业科学院 植物保护研究所,江西 南昌 330200;2.江苏省农业科学院 植物保护研究所,江苏 南京 210014;3.江西省宁都县农业农村局,江西 宁都 342800)

东乡野生稻(OryzarufipogonGriff.)具有宿根(多年生),再生力和繁殖(无性)力强,耐旱、耐贫瘠及多种抗逆性等有利性状，它还含胞质不育基因、广亲和基因、恢复基因、抗病虫基因等多种有利基因[1-2]。其中,其耐冷基因在水稻育种上最先取得了实际应用,已选育出在南昌自然条件下越年生粳稻品种(品系)4913-1[3-4]。姜文正等[5]指出东乡野生稻9个群落的抗病性各不相同,多数群落对黄矮病免疫,抗白叶枯病、稻瘟病；半数以上群落对白叶枯病、细条病表现多抗。黄瑞荣等[6-7]对东乡野生稻在较多材料来源的基础上进行抗病性鉴定,发现东乡野生稻感稻瘟病,但对白叶枯病和细条病抗性好,同时发现有5份材料对以上3种病害均表现抗性,为理想的抗源材料。然而,东乡野生稻对稻曲病的抗性情况尚不清楚。

高效、准确的人工接种技术可以减少抗性鉴定工作中客观条件的影响和限制,增加鉴定工作的可靠性,加快鉴定工作的进行。对于常规栽培水稻,张君成等[8]、王疏等[9]、林瑜凡等[10]在接种体、接种方法、接种浓度、接种水稻生育时期等多方面做过深入而全面的研究,形成了比较成熟可靠的人工接种技术。但东乡野生稻与常规栽培稻在生物学性状、生理生化及生长生育等方面存在着一定的差异,东乡野生稻不同单株间也存在生物学性状的不同,因此现有稻曲病人工接种技术是否在东乡野生稻上适用尚不确定。本试验选择3株东乡野生稻单株作为接种材料,重点研究了水稻生长时期、接种体、接种时间、接种方法等4个因素对接种效果的影响,以期获得成熟的东乡野生稻人工接种技术,为开展东乡野生稻抗稻曲病的研究工作奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试水稻的种植与管理

1.1.1 东乡野生稻的种植与管理 由于东乡野生稻不同单株间抽穗量及抽穗时间不同,因此为方便接种技术研究的开展,同时验证该技术在东乡野生稻上的适用性,从107份东乡野生稻单株中选择3株抽穗较多、抽穗时间较为一致的单株DX13(A)、DX35(B)和DX67(C)进行研究,每个单株种植10丛,分别编号为A1、A2,…,A10;B1、B2,…,B10;C1、C2,…,C10。东乡野生稻单株在自然条件下按常规方法进行管理,防治虫害但不防治病害。

1.1.2 两优培九的种植与管理 以感病栽培水稻两优培九作为对照品种。两优培九于6月5日播种第一批,之后每隔7 d播种1批,共播种5批。移栽秧龄35 d,每批移栽10行,每行8丛,株行距21 cm×25 cm;设保护行和工作行。两优培九在自然条件下按常规方法进行管理,防治虫害但并不防治病害。

1.2 稻曲病菌菌株

供试强致病力稻曲病菌菌株UvB367由江苏省农业科学院植物保护研究所刘永锋研究员提供。

1.3 试验方法

1.3.1 东乡野生稻不同生长时期人工接种试验 采用注射接种方法,以菌丝片段-分生孢子混合液为接种体;选择东乡野生稻及两优培九生育期处于剑叶与倒二叶叶枕距为(2±0.5)、(4±0.5)、(6±0.5)cm的稻穗于当日16:00～17:00进行接种。

1.3.2 不同接种体人工接种试验 不同接种体的制备方法及其接种方法如下。

1.3.2.1 厚垣孢子 取上年使用UvB367接种后发病收集起来并在-20 ℃保存的稻曲球，放入马铃薯蔗糖液体(PS)培养基中,振荡洗脱稻曲球表面的厚垣孢子,用纱布过滤掉杂质及稻曲球；取滤液在血球计数板下计数并将厚垣孢子浓度稀释至1×106个/mL，备用。

1.3.2.2 菌丝片段-分生孢子混合液 将5～6粒UvB367菌块从培养皿转移至100 mL PS培养基中,以135 r/min在28 ℃条件下震荡培养6～7 d,将所有摇瓶中的培养液混合后用组织捣碎机粉碎,取少量在血球计数板下计数并将培养液稀释至分生孢子浓度为1×106个/mL。将稀释后的培养液充分混匀并平均分为3份,第1份即为菌丝片段-分生孢子混合液接种体。

1.3.2.3 分生孢子悬浮液 取1.3.2.2中获得的第2份稀释培养液用4层灭菌纱布过滤,用少量无菌水冲洗纱布后将滤液收集并以8000 r/min离心[8],去上清留沉淀,随后用PS将沉淀重悬浮至分生孢子浓度为1×106个/mL,备用。

1.3.2.4 菌丝片段 取1.3.2.2中获得的第3份稀释培养液用4层灭菌纱布过滤,用少量无菌水冲洗纱布后用灭菌镊子将纱布上所有菌丝挑至PS培养基中,将培养基定容至与第3份培养液过滤前相同的体积,备用。

采用注射接种法于16:00～17:00将上述不同接种体接种至东乡野生稻及两优培九稻穗中。依据1.3.1中的试验结果,东乡野生稻与两优培九分别选择叶枕距为(4±0.5)cm及(6±0.5)cm的稻穗进行接种。

1.3.3 当日不同时间人工接种试验 采用菌丝片段-分生孢子混合液于当日8:00～9:00、12:00～13:00和16:00～17:00分别进行接种,接种方法及接种水稻的生长时期同1.3.2。

以上3个试验在东乡野生稻A1～A9、B1～B9、C1～C9以及所有种植批次两优培九1～8行中满足相应条件的稻穗上进行。由于东乡野生稻满足接种条件的稻穗较少,因此每个处理东乡野生稻接种3～5个穗,对照品种两优培九接种10个穗。

1.3.4 不同接种方法的人工接种试验 分别研究医用注射器注射接种和喷雾器喷雾接种对东乡野生稻稻曲病的接种效果。

1.3.4.1 注射接种 用规格为5 mL的医用注射器将孢子浓度为1×106个/mL的菌丝片段-分生孢子混合液从水稻穗中上部位注射入穗苞中,每穗注射2 mL,不超过2 mL的以菌液从穗苞顶端流出为准；接种时间及接种水稻的生长时期同1.3.2。

1.3.4.2 喷雾接种 用SeeSa“SX-CS5F”型气压式喷雾器(工作压力:3 hPa)将孢子浓度为1×106个/mL的菌丝片段-分生孢子悬浮液喷射到符合条件的稻穗上,喷射量以菌液在穗苞上聚成滴但又不滴下为准；接种时间及接种水稻的生长时期同1.3.2。

注射接种在东乡野生稻A1～A9、B1～B9、C1～C9以及不同批次两优培九1～8行中满足相应条件的稻穗上进行,喷雾接种在东乡野生稻A10、B10、C10以及不同批次两优培九第10行中满足相应条件的稻穗上进行。

1.4 试验调查统计

于接种后10 d第一次调查接种水稻稻曲病的发病情况,之后每隔7 d调查一次,以水稻接近成熟时稻曲球不再增加为止。调查每个接种稻穗上稻曲球个数,统计各处理稻曲球平均数。

2 结果与分析

2.1 水稻生长时期对接种效果的影响

调查结果显示,在东乡野生稻DX13、DX35、DX67生长至剑叶与倒二叶叶枕距为(4±0.5)cm时接种,其稻曲球平均数明显高于水稻剑叶与倒二叶叶枕距为(6±0.5)cm时接种;栽培稻两优培九在生长至剑叶与倒二叶叶枕距为(6±0.5)cm时接种,其稻曲球平均数明显高于剑叶与倒二叶叶枕距为(4±0.5)cm时接种(表1)。结果表明,东乡野生稻与两优培九的稻曲病接种最适时期并不一致(图1)。东乡野生稻DX13、DX35、DX67与栽培稻两优培九在叶枕距为(2±0.5)cm时接种均未诱发稻曲病,表明孕穗初期接种不利于诱发稻曲病(表1);试验发现此时接种还容易导致不抽穗或抽穗后稻粒空壳现象。

表1 水稻在不同生长时期接种后稻曲病的发病情况

图1 在水稻不同生长时期接种后稻曲球平均数

2.2 接种体对接种效果的影响

调查结果(表2)显示：以菌丝片段-分生孢子混合液为接种体接种东乡野生稻DX13、DX35、DX67及两优培九时,诱发稻曲病的效果最好；以菌丝片段和分生孢子悬浮液为接种体接种时诱发效果次之；以厚垣孢子接种未能诱发东乡野生稻及两优培九的稻曲病。结果表明,不同接种体接种对东乡野生稻稻曲病的诱发效果不同,但对东乡野生稻稻曲病的诱发效果趋势与两优培九保持一致(图2)。

表2 不同接种体接种后稻曲病的发生情况

2.3 接种时间对接种效果的影响

调查结果显示,于8:00～9:00、12:00～13:00和16:00～17:00三个时间段对东乡野生稻DX13、DX35、DX67及两优培九接种均可诱发稻曲病(表3),但病害严重度差异明显,其中以16:00～17:00时接种的病情最为严重,其次为8:00～9:00时接种，而在12:00～13:00时接种的病情最轻(图3)。结果表明,在一天中16:00～17:00接种最有利于东乡野生稻稻曲病的发病,这与两优培九的最佳接种时间段是一致的。

接种体A:厚垣孢子;接种体B:分生孢子悬浮液;接种体C:菌丝片段;接种体D:菌丝片段-分生孢子混合液。

图2 不同接种体接种后稻曲球平均数表3 一天中不同时间接种后稻曲病的发生情况

图3 一天中不同时间接种后稻曲球平均数

2.4 接种方法对人工接种效果的影响

调查结果(表4)显示：注射接种可诱发东乡野生稻DX13、DX35、DX67及两优培九稻曲病的发生；喷雾接种未能诱发东乡野生稻任何单株稻曲病的发生；喷雾接种可诱发两优培九稻曲病的发生,但病情严重度明显低于注射接种的水稻(图4)。该结果表明,注射接种更有利于诱发东乡野生稻稻曲病的发生。

3 总结与讨论

本研究采用不同接种体、不同接种方法,在水稻不同生长时期,于一天中不同时间对3株东乡野生稻单株进行稻曲病人工接种试验,探索了东乡野生稻稻曲病人工接种技术。结果表明,当水稻生长至剑叶与倒二叶间距为(4±0.5)cm时,以菌丝片段-分生孢子混合液作为接种体,采用注射的方法于一天中16：00～17：00时进行接种对东乡野生稻诱发稻曲病效果最好。这一结果有助于指导东乡野生稻的抗病性鉴定,筛选抗性群体及抗性个体,挖掘优异野生抗性种质。

表4 用不同方法接种后稻曲病的发生情况

图4 用不同方法接种后稻曲球平均数

王疏等[9]、林瑜凡等[10]报道厚垣孢子可引起稻曲病的发生；王舒婷[11]则报道厚垣孢子未能引起稻曲病的发生。张君成等在2003年[12]报道了接种厚垣孢子的稻曲病发病率，但其病情指数均很低；2004年他却又报道接种厚垣孢子没有引起稻曲病的发病[8]。以上结果表明以厚垣孢子为接种体诱发水稻稻曲病的效果存在不稳定性。在本研究中，厚垣孢子同样没有引起东乡野生稻与两优培九的发病。相反,接种体菌丝片段-分生孢子对稻曲病有较好的诱发效果得到了较多学者[8,11,13-14]的认可,本研究也得到了类似的结果。因此,在东乡野生稻稻曲病人工接种中建议以菌丝片段-分生孢子混合液作为接种体。

张君成等[8]报道在水稻两优培九破口前6～9 d接种对稻曲病的诱发效果最好;代海霞等[13]报道水稻冈优305在破口前4 d接种时的稻曲病发病效果好于在破口前7 d接种时的发病效果,表明不同水稻品种稻曲病诱发的最佳时期与破口期的间距不同。据杨秀娟等[14]报道，两优培九在孕穗期剑叶与倒二叶叶枕距为8～9 cm时接种诱发的稻曲球平均粒数高于在0～7 cm及10～13 cm时接种诱发的稻曲球平均粒数,这与贾切[15]的研究结果“水稻粤优938幼穗在剑叶与倒二叶叶枕距16～17 cm时接种诱发的稻曲病病穗率显著高于在0～10 cm时接种诱发的稻曲病病穗率”不同,表明不同水稻品种处于稻曲病最佳诱发时期时剑叶与倒二叶叶枕距也不相同。本研究中东乡野生稻与栽培稻两优培九处于稻曲病最佳诱发时期时剑叶与倒二叶叶枕距的不同也进一步证实了该结论。因此,在进行多个水稻品种抗稻曲病人工鉴定时,以固定的稻穗破口前某一天或者统一的剑叶与倒二叶叶枕距进行接种虽然接种条件一致,但反而会导致结果存在一定的误差,建议对筛选出来的抗性材料在多个生长时期下接种以进行进一步的验证,这样得到的抗性鉴定结果会更加可靠。