高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法测定人尿中硒形态

刘 源，陈绍占，陈 镇，姚晓慧，周天慧，刘丽萍*

(1.首都医科大学 公共卫生学院，北京 100069；2.北京市疾病预防控制中心 食物中毒诊断溯源技术北京市重点实验室，北京 100013；3.北京市预防医学研究中心，北京 100013)

硒作为人和动物必需的微量元素，在人类健康中起着非常重要的作用，硒摄入不足或过量均可导致疾病。世界卫生组织公布的数据显示，全球40多个国家存在低硒或缺硒的情况[1]。适量补充硒可对某些癌症起到预防作用[2-5]。目前，膳食补硒是最为直接便捷的硒补充途径[6]。硒化物存在不同形态，无机形态的硒化物中，单质硒无毒，亚硒酸钠的毒性大于硒酸钠，H2Se的毒性比SeO2大5倍[7]；而硒代胱氨酸(SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)、硒代蛋氨酸(SeMet)等有机硒富有营养，便于动物体吸收利用。因此，建立人尿中硒形态的测定方法，探究硒在人体中的代谢转化规律，对于硒在生物体中的利用、代谢过程研究及其营养作用评估具有重要意义。

硒形态的分离检测技术主要有体积排阻色谱(SEC-HPLC)、反相离子对色谱(RP-IP-HPLC)、液相色谱-原子荧光光谱(LC-AFS)、高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱(HPLC-ICP/MS)等。其中，HPLC-ICP/MS凭借其灵敏度高、分离效果好、线性范围宽等优点，广泛应用于食品与生物样本中硒形态的分析研究。曹玉嫔等[8]采用HPLC-ICP/MS测定牛蒡和三七中的硒形态，但只能分离4种硒形态。王丙涛等[9]利用HPLC-ICP/MS测定食品中SeCys2、亚硒酸盐Se(Ⅳ)、SeMet、硒代乙硫氨酸(SeEt)、硒酸盐Se(Ⅵ)5种硒形态，但分析时间长达21 min。张硕等[10]使用RP-8反相色谱整体柱和自制的高灵敏度原子荧光光谱系统，分离了SeCys2、Se(Ⅳ)、SeMet、Se(Ⅵ)4种硒形态。喻宏伟等[11]使用HPLC-ICP/MS在RP18反相色谱柱上分离了人尿中的5种硒形态，但部分质子化组分在主峰后形成干扰峰，给定量分析带来误差。Chatterjee等[12]使用GS-220色谱柱分离了人尿中Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ)和三甲基硒离子(TMSe+)3种硒形态，但其实用性受到限制。Moreno等[13]使用Phenomenex Luna C18色谱柱分析人尿中硒形态，但MeSeCys与Se(Ⅳ)未完全分离。目前，使用阴离子交换色谱进行硒形态分离的文献报道最多[14-15]。为更好地探究硒在人体中的吸收代谢情况，本文采用直接稀释/HPLC-ICP/MS法对人尿中SeCys2、MeSeCys、Se(Ⅳ)、SeMet、Se(Ⅵ)5种硒形态进行分析，可为进一步研究硒与人体健康的关系提供技术支持。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

1260 型高效液相色谱仪及7700x型电感耦合等离子体质谱仪(美国Agilent公司)；Hamilton PRP-X100阴离子交换柱(250 mm×4 mm，10 μm)及其保护柱(美国哈密尔顿公司)；Milliplus 2150超纯水处理系统(美国密理博公司)；数控超声清洗器(可控温20～80 ℃，昆山市超声仪器有限公司)。超纯水：电阻率18.2 MΩ·cm；磷酸氢二铵((NH4)2HPO4，国药集团化学试剂有限公司)为优级纯；甲醇(美国Sigma公司)、甲酸(ROE Scientific公司)为色谱纯；蛋白酶XIV(美国Sigma公司)；SeCys2、MeSeCys、Se(Ⅳ)、SeMet、Se(Ⅵ)溶液标准物质均购于中国计量科学研究院。

1.2 样品前处理方法

直接稀释法：取1 mL尿样于15 mL离心管中，加入2 mL超纯水稀释，涡旋30 s，9 000 r/min离心10 min，取上清液过0.22 μm水系滤膜，同时做空白对照。

超声酶解法：取1 mL尿样于15 mL离心管中，加入2 mL超纯水稀释，涡旋30 s，分别加入10、20 mg的蛋白酶XIV并于37 ℃下加热超声1 h，9 000 r/min离心10 min，取上清液过0.22 μm水系滤膜，同时做空白对照。

1.3 测定方法

色谱条件：色谱柱：Hamilton PRP-X100阴离子交换柱(250 mm×4 mm，10 μm)；流动相：40 mmol/L(NH4)2HPO4(含1%甲醇，pH 5)；流速：1.2 mL/min，数据采集时间：13 min；进样量：100 μL。

ICP/MS条件：RF入射功率：1 550 W，载气：高纯氩气，载气流速：0.70 L/min，辅助气流速：0.45 L/min，射频电压：1.80 V，采样深度：8.0 mm，泵速：0.3 r/s。

图1 5种硒形态的色谱图(25 μg/L)

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

选择40 mmol/L(NH4)2HPO4作为流动相，考察了流动相pH值对5种目标硒形态分离度的影响。结果显示，当pH<5时，MeSeCys与Se(Ⅳ)的分离度较差；当pH=5时，5种硒形态的分离度最好；当pH>5时，5种硒形态的分析时间明显缩短，但分离度变差；当pH>7时，部分硒形态不能出峰。实验发现，在流动相中加入1%甲醇可以增强信号强度，且不影响硒形态的分离度，因此最终选择40 mmol/L(NH4)2HPO4(含1%甲醇，pH 5)作为流动相。本方法为等度洗脱，为缩短分析时间，调节流动相流速为1.2 mL/min，可在13 min内完成样品测定(见图1)。

2.2 前处理方法的优化

分别采用直接稀释法和超声酶解法对新鲜尿样进行分析，结果见表1。结果表明，新鲜尿样经超声酶解法预处理后，随着加酶量的增加，测得SeCys2及Se(Ⅳ)的质量浓度减少，SeMet及Se(Ⅵ)增加，而总硒形态减少。由此可见，超声酶解法会改变尿中硒形态，不适用于尿中硒形态的预处理。因此，本实验采用直接稀释法进行前处理，可以满足分析要求。

表1 两种预处理方法对尿中硒形态分析结果的比较

Table 1 Comparison of analysis results for selenium speciations in urine by two pretreatment methodsρ/(μg·L-1)

Sample SeCys2MeSeCysSe(Ⅳ)SeMetSe(Ⅵ)Total selenium speciationSample 1 direct dilution(尿样1直接稀释)14.3-∗3.73--18.1Sample 1+10 mg enzyme(尿样1+10 mg酶)4.20-2.152.101.8410.3Sample 1+20 mg enzyme(尿样1+20 mg酶)1.22-1.602.931.897.64Sample 2 direct dilution(尿样2直接稀释)7.06-2.17--9.24Sample 2+10 mg enzyme(尿样2+10 mg酶)4.18-1.431.721.208.53Sample 2+20 mg enzyme(尿样2+20 mg酶)2.24-1.082.191.827.34

*not detected

2.3 线性范围与检出限

在最佳实验条件下，分别配制0.5、1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0、200.0、300.0 μg/L的SeCys2、MeSeCys、Se(Ⅳ)、SeMet、Se(Ⅵ)混合标准溶液，采用本方法进行测定，以各形态的色谱峰面积(y)与对应质量浓度(x，μg/L)绘制标准曲线。结果表明，5种硒形态在0～300.0 μg/L质量浓度范围内线性较好，相关系数(r)均大于0.999(见表2)。

检出限采用逐级稀释法测定，以3倍基线噪声(S/N=3)时硒形态的质量浓度为检出限，SeCys2、MeSeCys、Se(Ⅳ)、SeMet、Se(Ⅵ)的检出限分别为0.2、0.2、0.2、0.5、0.3 μg/L(见表2)。

表2 方法的线性关系及检出限

2.4 方法准确性

采用加标回收实验考察方法准确性。选取1个尿样，分别添加10.0、30.0、70.0 μg/L 3个浓度水平的5种硒形态混合标准溶液，平行制备6个样品进行测定，结果见表3。结果显示，SeCys2的加标回收率为37.7%～70.4%，其余4种硒形态的回收率为80.0%～123%。

针对SeCys2加标回收率较低的情况，选择上述同一尿样进行了SeCys2单标加标实验，加标浓度为20 μg/L,SeCys2的回收率仅为37.0%和35.2%。综合加标回收实验的结果，发现尿液基质对SeCys2测定有影响，具体影响机理有待进一步研究。

表3 5种硒形态的加标回收率与相对标准偏差(n=6)

*not detected

2.5 方法精密度

2.5.1 实际样品的精密度以相对标准偏差(RSD)表示精密度。选取1个尿样，制备6个平行样品，采用本方法测定其硒形态的含量，分别计算RSD。结果表明，5种硒形态的RSD均不大于7.8%。

2.5.2 模拟样品的精密度向实际尿样中加入3个浓度水平的5种硒形态混合标准溶液，制备成模拟样品，采用本方法测定硒形态的含量，分别计算RSD。由表3可知，5种硒形态的RSD均不大于4.7%。

2.6 实际样品的测定

采用本方法对6名志愿者的随机尿样与40份送检随机尿样进行硒形态测定。结果显示，6名志愿者的尿样中主要硒形态为SeCys2，质量浓度为1.88～11.4 μg/L，占测得总硒形态的57.2%～82.6%，另有少量的MeSeCys、Se(Ⅳ)、SeMet和Se(Ⅵ)；同时发现1份志愿者尿样在Se(Ⅵ)峰后出现未知形态1(U1)，见图2A；1份志愿者尿样在SeCys2峰前出现未知形态2(U2)，见图2B。40份送检尿样中主要硒形态为SeCys2，质量浓度为0.77～3.16 μg/L，占测得总硒形态的41.9%～88.0%，另有少量的MeSeCys、Se(Ⅳ)、SeMet和Se(Ⅵ)，在部分送检尿样中发现SeCys2峰前出现未知形态3(U3)，见图2C，其保留时间与U2相近。对于未知形态的具体成分有待进一步分析。

图2 尿样1(A)、尿样2(B)与尿样3(C)的硒形态色谱图

3 结 论

本研究建立了尿液中5种硒形态的高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱分析方法，比较了超声酶解法与直接稀释法的提取效果，并优化了测定条件，可在13 min内完成5种硒形态分析。采用该方法对实际样品进行测定，发现人体尿液中硒形态主要以SeCys2为主，同时含有少量MeSeCys、SeMet、无机硒及未知含硒化合物。该方法具有样品前处理简便、灵敏度高、精密度好、准确可靠等优点，除了SeCys2的加标回收率较低外，其余4种硒形态的回收率可以满足分析要求。研究结果可为探究硒在人体中的吸收代谢情况和进一步研究硒与健康的关系提供技术支持。