固相微萃取/气相色谱-质谱联用技术测定燕窝中挥发性成分

柳训才，张小江，张晓婷，徐敦明，范群艳*

( 1.燕之屋丝浓食品有限公司燕窝技术中心，福建 厦门 361100；2.厦门海关检验检疫技术中心，福建 厦门 361026)

燕窝为雨燕科金丝燕舌下腺分泌的唾液凝结于悬崖、洞内峭壁上或楼屋内的横梁上筑成的巢窝，主产于印度尼西亚、马来西亚、泰国、越南等地[1-4]。其性平，味甘，有补肺养阴的作用，自古以来被视为一种食补极品、名贵药材。其中表皮生长因子、唾液酸、人体必需氨基酸、矿质元素、维生素B1、牛磺酸、糖蛋白等成分的发现很好地诠释了燕窝诸多的生物功效，如促进表皮生长、滋阴养肺、化痰止咳、抗氧化、抗病毒、延缓衰老、保护软骨组织等[5-7]。

未经炖煮的燕窝具有一种类似生蛋清的特殊气味，研究构成这种特殊性气味的挥发性成分组成及含量变化对了解燕窝的气味特征，探索燕窝品种/产地的鉴定、燕窝质量的控制均具有十分重要的意义。但由于燕窝中挥发性成分含量低、易挥发、难萃取和浓缩，因此，有必要建立一种快速简便的燕窝挥发性成分提取和检测新技术。目前对于食品中挥发性成分的分析通常采用感官分析[8-9]、气相色谱-质谱联用(GC-MS)[10-12]、气相色谱-嗅闻(Gas chromatography olfactometry,GC-O)[13-14]和电子鼻(Electronic nose,Enose)[15-17]等。其中，气相色谱-质谱联用更能有效地对成分进行定性与定量分析。而固相微萃取(SPME)技术是一种集萃取、浓缩、进样于一体的样品前处理新方法，具有快速简单、费用少、易于自动化、不需要溶剂等优点[18]，已广泛应用于药用[19]和香料植物[20]、茶叶[21]、肉类[22]和农药残留量[23]检测的样品前处理，但尚未利用此项技术在燕窝中进行气味研究。鉴于此，本文采用固相微萃取结合气相色谱-质谱联用技术探索燕窝中挥发性成分的参数条件，以期为燕窝的鉴定和质量控制提供科学依据和实践指导。

1 实验部分

1.1 供试材料

产地为印尼的燕盏，由厦门燕之屋丝浓食品有限公司提供。

1.2 仪器

气相色谱-质谱联用仪(岛津公司，GCMS-TQ8040)，配石英毛细管色谱柱(Agilent公司，DB-5MS，30 m×0.25 mm，0.25 μm)；SPME手动进样器及65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯(PDMS/DVB)萃取头(Supelco公司，57330-U和57320-U)；水浴锅(群安实验仪器有限公司，BHS-2)。

仪器参数：进样口：温度250 ℃，进样时间2 min，不分流进样，2 min开启隔垫吹扫；程序升温：初始温度40 ℃，保留2 min,以10 ℃/min的速率升至260 ℃，保留6 min；载气：He，流速：1.0 mL/min；接口温度：260 ℃；电子轰击离子源(EI)：230 ℃，电离能量：70 eV；质谱模式：正离子，Q3 SCAN，离子扫描范围(m/z)：45～400。

1.3 实验方法

将燕盏粉碎成1 mm左右的颗粒，称取6 g样品于20 mL顶空瓶中，密封后将顶空瓶置于60 ℃水浴锅中平衡20 min。再插入经过热清洗的65 μm PDMS/DVB萃取头进行顶空萃取，继续保温60 min。保温结束后立即将萃取头插入GC-MS进样口进行测定。

2 结果与讨论

2.1 萃取头的选择

在相同的萃取及测定条件下，比较了100 μm聚二甲基硅氧烷(PDMS)、65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯(PDMS/DVB)、75 μm碳分子筛/聚二甲基硅氧烷(Carboxen/PDMS)、85 μm聚丙烯酸酯(Polyacrylate)4种萃取头对挥发性成分的萃取效果，扣除掉样品空白的背景峰后，4种萃取头分别进样测定总离子流图(TIC)的峰数和总峰面积，结果见表1。

表1 4种萃取头对燕窝中挥发性成分的吸附效果

根据SPME产品手册说明，PDMS通常用于非极性挥发性化合物(MW 60～275)，Carboxen/PDMS用于气体和低分子量化合物(MW 30～225)，Polyacrylate用于极性半挥发性化合物(MW 80～300)，而PDMS/DVB用于挥发性物质、胺类、硝基芳香类化合物(MW 50～300)，其适用范围更广。表1的数据也证实了此结论，无论从峰数还是总峰面积，65 μm PDMS/DVB的萃取效果均强于其它3种萃取头，另外3种萃取头中，PDMS和Polyacrylate的总离子流图的峰数相近，且优于Carboxen/PDMS。此外，尽管萃取头固定相的膜厚对萃取效果有重要影响，且较厚的膜更容易萃取高沸点化合物，但从表1可知，SPME固定相的极性比膜厚对萃取效率的影响更大。因此，实验最终选择65 μm的PDMS/DVB萃取头对燕窝中的挥发性成分进行萃取。

图1 萃取温度对SPME萃取燕窝中挥发性成分的影响

2.2 萃取温度的影响

为考察温度对PDMS/DVB萃取效果的影响，实验比较了萃取时间为30 min，温度分别为40、50、60、70、80、90、100 ℃时，进样测定总离子流图(TIC)的出峰数和总峰面积(见图1)。由图1可见，随着萃取温度不断的升高，可检出萃取物的总峰数和总峰面积不断增大。从图2可观察到，萃取温度越高，绝大部分检出物的含量均有提高，且保留时间大于15 min时含量提高程度更显著。二图均显示，随着萃取温度的升高，燕窝中一些分子量大且较难挥发的物质逐步从燕窝中释放出来，且在100 ℃时仍呈上升趋势。考虑到后续将对SPME的测定数据与室温下的感官嗅觉进行比较，本研究最终选择60 ℃作为萃取温度。

图2 萃取温度为60 ℃(黑)与80 ℃(红)时燕窝中挥发性成分的TIC图

图3 萃取时间对SPME萃取燕窝中挥发性成分的影响

2.3 萃取时间的影响

为考察萃取时间对PDMS/DVB萃取效果的影响，实验比较了60 ℃下萃取时间分别为10、20、30、40、50、60、80、100、120、150 min时的测定结果(见图3)。结果显示，随着萃取时间的延长，萃取头萃取的挥发性成分的总峰面积不断升高，在60 min后变得平缓，120 min时接近平稳，表明65 μm的PDMS/DVB萃取头在120 min时达到吸附-解吸的平衡；进一步比较萃取时间为60 min和120 min时燕窝中挥发性成分的TIC图(图4)，发现随着萃取时间的延长，总峰面积的增加来自于保留时间较长(沸点较高)的峰的贡献。如保留时间为11.13 min的正壬醇，在60 min后已基本趋于饱和，而对于保留时间为17.85 min的1-十四碳醇，在120 min后峰面积仍有很大变动，相对于60 min处，其峰面积增加了约1/3。而峰数随萃取时间的延长变化不大，在151～176 之间波动(平均值为164 个)，峰数的波动可能是由低含量的高沸点成分的色谱峰高在识别限值附近轻微波动，被积分参数中设置的阈值过滤掉所导致。鉴于萃取效率在60 min后逐渐趋于平缓，且所萃取的成分已具有一定代表性，因此选择60 min作为本实验的萃取温度。

2.4 解吸时间的影响

比较了解吸时间分别为0.5、2、3、4、5 min时，TIC图的总峰面积及峰数目。结果表明，不同解吸时间下，TIC图中的峰面积在1.70×108～1.68×108，峰数在143～150 个之间波动，2 min即能够将SPME中萃取的物质完全解吸出来；继续延长解吸时间,解吸效果差别不大。因此实验选择2 min作为最佳解吸时间(GC-MS进样时间)

图4 萃取时间为60 min(黑)与120 min(红)时燕窝中挥发性成分的TIC图

2.5 重复性实验

为考察该测定方法的重复性，按照“1.3”进行燕窝样品的处理和测定，连续平行测定6次，分别计算TIC图中的峰数和总峰面积。结果显示，连续平行测定6次，TIC图中峰数值的相对标准偏差(RSD)为0.99%，总峰面积的RSD为0.62%。方法具有较好的重复性，可用于燕窝中挥发性成分的测定。但需指出的是，因SPME萃取头的使用寿命较短(本实验所用SPME萃取头的使用参数为50～100 次)，在考虑方法的再现性时需对SPME的性能状态予以重视。

2.6 成分分析

按照“1.3”进行燕窝样品的处理，测定其挥发性成分(见图5)，同时做样品空白。将测定结果扣除样品空白后，对色谱峰逐一以NIST 14与NIST 14s质谱数据库进行检索分析，并以峰面积归一法确定组分中挥发性成分的相对含量(见表2)。结果显示，燕窝气味构成复杂，其中以烃类(43种)、醇类(16种)、醛类(17种)、醚类(4种)、酯类(4种)为主，含量占比分别为39.29%、21.94%、17.77%、7.23%、4.06%，其余为酮类、酸类、酚类、噻唑类、吡喃类，共计82种，共同组成了燕窝的特殊气味。

图5 SPME/GC-MS测定时燕窝中挥发性成分的TIC图

表2 燕窝中挥发性成分以NIST 14和NIST 14s进行检索的结果

(续表2)

No.Retention time(min)CASComponentContent(%)Similarity(%)5515.8752425-77-61-Decanol,2-hexyl-(2-己基-1-癸醇)0.49895616.07013475-75-7Pentadecane,8-hexyl-(8-己基十五烷)0.62865716.28827538-41-611-Methyltricosane(11-甲基二十三烷)0.96885816.3644337-65-9Hexanedioic acid,mono(2-ethylhexyl)ester(己二酸1-(2-乙基己基)酯)2.24835916.525112-95-8Eicosane(正二十烷)1.13926016.6092882-96-4Pentadecane,3-methyl-(3-甲基十五烷)1.86936116.961629-94-7Heneicosane(正二十一烷)2.46966217.20325117-26-4Hexadecane,4-methyl-(4-甲基十六烷)0.10836317.3551560-89-0Heptadecane,2-methyl-(2-甲基十七烷)0.09806417.415119-61-9Benzophenone(二苯甲酮)0.46966517.5063892-00-0Pentadecane,2,6,10-trimethyl-(2,6,10-三甲基十五烷)1.23926617.54624851-98-7Cyclopentaneacetic acid,3-oxo-2-pentyl-,methyl ester(二氢茉莉酮酸甲酯)0.28826717.6631795-21-7Cyclopentane,decyl-(1-环戊基癸烷)0.93886817.6981561-02-02-Methylhexacosane(2-甲基二十六烷)0.45836917.851112-72-11-Tetradecanol(1-十四碳醇)0.76807017.9293075-84-11,1′-Biphenyl,2,2′,5,5′-tetramethyl-(2,2′,5,5′-四甲基联苯)0.56837118.121629-78-7Heptadecane(正十七烷)1.03937218.1551921-70-6Pentadecane,2,6,10,14-tetramethyl-(2,6,10,14-四甲基-十五烷)0.73807318.29326627-85-0Hexacosanal(正二十六碳醛)0.32857418.75126429-11-8Heptadecane,4-methyl-(4-甲基十七烷)0.21837518.9066418-44-6Heptadecane,3-methyl-(3-甲基十七烷)0.33937619.447110-27-0Isopropyl myristate(十四酸异丙酯)0.03807719.6231120-36-11-Tetradecene(1-十四烯)0.14887819.7821222-05-5Cyclopenta[g]-2-benzopyran,1,3,4,6,7,8-hexahydro-4,6,6,7,8,8-hexamethyl-(佳乐麝香)0.05817920.05736653-82-41-Hexadecanol(1-十六碳醇)0.83978020.6725333-42-61-Dodecanol,2-octyl-(辛基十二烷醇)0.09908121.67018435-45-51-Nonadecene(1-十九碳烯)0.06908222.0682004-39-91-Heptacosanol(1-二十七碳醇)0.0794

3 结 论

本文建立了SPME/GC-MS 检测燕窝中挥发性成分的分析方法，并对实验条件进行了优化。实验结果显示，以65 μm PDMS/DVB萃取头在60 ℃下吸附60 min，解吸2 min后，采用GC-MS对燕窝样品进行测定并辅以NIST 14和NIST 14s检索，可获得较好的分析结果，检出醇、烃、醛、酯、醚类等化合物共82种。该方法具有吸附效果好，检测灵敏度高，无需溶剂，直接进样，且操作简单快速的特点，因而是一种很有应用前景的技术，有望广泛用于燕窝挥发性成分的测定。