辣木叶粉酵母发酵破壁提取和纯化工艺研究

吕禹泽，丁小梅，王 力，赖海涛

（集美大学 食品与生物工程学院，福建 厦门 361021）

辣木又名鼓槌树［1］，是一种辣木科的速生多功能植物，广泛种植在包括泰国在内的亚热带和热带地区［2］，在食品和医疗领域中应用研究日益深入、成熟.其种子、树叶、树皮、根和花均含有丰富的营养物质［3］，包括蛋白质、必需氨基酸、维生素（维生素A、B、C和E）、矿物质（铁、钙和钾等）和其他营养素（γ-氨基丁酸和β-胡萝卜素等）［4-7］，拥有“生命之种”和“奇迹之树”的美名［8-9］.同时，辣木不仅可以食用，还具有重要医用价值［1］.其中辣木的根在反复性发热的治疗方面具有奇效［10］；辣木的种子含有丰富的油脂类（19%～47%），蛋白质（10%～52%）和芥子油苷（2.5%～20%）等，其种子油中富含不饱和脂肪酸（如油酸等），如今已被用作优质植物油和传统药物，用于治疗关节炎、风湿病和高血压［11］；辣木的花对肌腱发炎或者脓肿有消炎作用［12］；辣木的树皮可帮助消化，治愈皮肤的感染及溃疡症状［13］；研究发现，辣木叶可用于治疗多种疾病，在伤寒、哮喘、咳嗽、寄生虫病、关节炎、糖尿病、割伤、皮肤红肿和皮肤疾病、泌尿生殖系统疾病、高血压、身体疼痛和无力等的治疗中具有重要作用［14］.

多酚类物质是辣木中重要的功能性成分之一，植株的多酚提取物的抗氧化性很强［15］.Vongsak等［16］人在选择传统的提取措施提取辣木多酚物质时，发现采用浸提的方法，以70%的乙醇溶液为提取剂能够取得最大的提取率，且所得的辣木提取液具有较好的抗氧化活性.为了提高多酚类物质的提取率，人们提出了许多方法，目前提取效果较为可观的方法有微波［17-18］、亚临界萃取［19］和超声波［20-21］等.这些方法其实都是通过破坏辣木组织细胞中的细胞壁，再通过一些溶剂将细胞中的物质溶解并提取出来，经过进一步的分离纯化获得高纯度的所需物质.故如何能使得植物的细胞壁破碎，对于提高对多酚的提取率具有重要意义.本文采用干性酵母-发酵方法对辣木叶粉进行破壁研究并以期得到最佳破壁条件及纯化工艺，为工厂规范化生产提供技术参数，为辣木叶粉作为天然饮料、保健品及化妆品等的研发提供依据.

1 材料与方法

1.1 材料、主要试剂及仪器 辣木叶粉：辣木叶由厦门天竺辣木种植基地提供，辣木叶经实验室处理后制得辣木叶干粉.高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；盐酸、福林酚试剂、磷酸氢二钠：分析纯，国药集团化学试剂有限公司，大孔树脂Sephadex LH-20：沧州宝恩吸附材料科技有限公司.

CP214型电子天平：美国OHAUS仪器（上海）有限公司；HH-4数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；RV8型旋转蒸发仪：厦门精艺兴业科技有限公司；ZX-15-07型冷冻干燥机：赛默飞世尔科技有限公司.

1.2 实验方法

1.2.1 辣木叶预处理 首先对实验室所购辣木叶进行筛选，选用新鲜的辣木叶，去除枯叶烂叶.将筛选的辣木叶在80 ℃下进行烘干处理.再放入搅拌机进行多次粉碎处理，直至辣木叶成相对均匀的粉状物.经上述步骤所得粉状物再过80目筛，最终获得实验所需的辣木叶粉，该辣木叶粉需在低温、避光、干燥的环境条件下保存.

1.2.2 总酚含量的测定 采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 显色法［22］，使用超纯水进行配制浓度为50 μg·mL-1的没食子酸标准液.室温下依次量取0～0.45 mL（0.05 mL的梯度间隔）浓度梯度的配制好的液体至10 mL比色管中.每个比色管分别加入超纯水定容至1 mL，再往比色管中加入1.5 mL福林酚溶液（由福林酚试剂与水比例1∶1配制而成）.将比色管内的液体充分摇晃混匀后放置在室温中反应3 min.反应结束之后分别往每个比色管中加入3 mL碳酸钠溶液（质量分数为12%），充分摇晃混匀后将比色管放置在暗处反应2 h.最后测每个比色管的A762值，测得数据用Origin作图［23］.

2 结果与分析

2.1 没食子酸的标准曲线 在电脑制图软件Origin中，以在762 nm下测得的吸光值A762为Y轴，不同浓度的没食子酸为X轴，完成标准曲线的绘制.由所得标准曲线（图1）可知：没食子酸在浓度0～50μg·mL-1与A762有着非常好的线性关系.本实验的标准曲线线性回归方程y＝0.0927x+0.00122，其相关系数为R2=0.9992.按照没食子酸的标准曲线线性回归方程可以计算得出在波长762 nm下，已知吸光度所对应的提取液中多酚的含量.

2.2 酵母发酵法条件的优化

2.2.1 干性酵母添加量 称取干燥的辣木叶粉10.0 g，加水20 mL 使辣木叶粉润湿溶解，改变酵母添加量，于32 ℃的培养箱内培养3 d，再置于37 ℃的水浴酶解6 h，见图1.从图1可知，干性酵母添加量对破壁后总黄酮含量的影响较为明显.随着酵母添加量的增大，破壁后的样品溶液中吸光度先逐渐增大，当酵母添加量为0.3%时，吸光度最大，即破壁后的样品溶液中总黄酮的含量达到最高，当酵母添加量大于0.3%时，破壁后的样品溶液中吸光度呈现减小趋势，即破壁后的样品溶液中总黄酮逐渐降低.故干性酵母添加量选取0.3%.

2.2.2 加水量 称取干燥辣木叶粉10.0 g，干性酵母添加量为0.3%，改变加入的辣木叶粉中加水量，其他条件同2.1.1，结果见图3.由图3可知，加水量对破壁后总黄酮含量的影响较大.随着加水量的增大，破壁后的样品溶液中吸光度先逐渐增大，当加水量为辣木叶粉量的4倍（40 mL）时，破壁后的样品溶液的吸光度达到最大，当加水量大于40 mL时，破壁后的样品溶液中吸光度呈现降低趋势，即破壁后的样品溶液中总黄酮逐渐降低.这是因为辣木总黄酮在提取溶剂中的溶解度随加水量的增加而增加所致，当加水量达到某一点时，提取率达到最大.但当继续增大加水量时，辣木叶中水溶性物质不断溶出，且提取液浓度降低，这些都不利于甚至会抑制辣木叶中总黄酮的渗出［24］.并且实际上在加水量为40 mL以上时，辣木叶粉在发酵过程中会出现了异味，不利于实验的进行.综合考虑后，最终确定加水量为30 mL较为合适.

2.2.3 培养时间 培养温度控制为32 ℃，其他条件同2.1.2，改变培养时间，结果见图4.由图4可知，随着培养时间的增大，破壁后的样品溶液中吸光度先逐渐增大，当培养时间为3 d时，破壁后的样品溶液的吸光度达到最大，即破壁后的样品溶液中总黄酮的含量达到最高.当培养时间大于3 d时，破壁后的样品溶液中吸光度呈现降低趋势，即破壁后的样品溶液中总黄酮逐渐降低.可能是因为提取时间过长，导致黄酮被氧化成其他物质，致使一部分黄酮丢失［25］.因此，综合考虑培养时间选择3 d作为培养时间为宜.

2.2.4 培养温度 辣木叶粉中加水量为30 mL，其他条件同2.1.3，改变培养温度，其实验结果如图5所示，由图可知温度对破壁后总黄酮含量的影响较为显著.随着培养温度的增大，破壁后的样品溶液中吸光度先逐渐增大，当培养温度达到32 ℃时，破壁后的样品溶液的吸光度达到最大，当培养温度大于30 ℃时，破壁后的样品溶液中吸光度呈现降低趋势，即破壁后的样品溶液中总黄酮逐渐降低.可能是因为干性酵母的最宜生长温度在28～32 ℃，温度过高或过低均不利于干性酵母的生长，从而导致破壁效果，并进一步影响辣木叶中黄酮的提取.因此，培养温度选择32℃为宜.

2.2.5 酵母发酵法最佳发酵条件下提取率 在上述最佳发酵条件下，经过实验可得辣木叶中的总黄酮含量，通过与未经酵母发酵破壁处理的采用水提取法所得的辣木叶中总黄酮含量对比可知（见表1），经过酵母发酵破壁处理后的辣木叶中总黄酮的提取率远大于未经酵母发酵破壁处理的水提取法的提取率.

表1 酵母发酵破壁与未破壁辣木叶粉提取率Tab.1 Extraction rate of moringa leaf powder broken and unbroken cell walls by yeast fermentation

2.3 Sephadex LH-20凝胶柱层析分离纯化辣木叶多酚的工艺条件研究 目前多酚分离纯化的较常用方法主要有大孔树脂法和高效液相色谱法，其中大孔树脂法以成本低、操作简单、可行性强、分离效果较好等特点，成为当前分离纯化多酚的较常用的方法之一.本文深入探讨Sephadex LH-20凝胶柱层析分离纯化工艺，以期为提高多酚的分离效果，获得高纯度的多酚类物质提供一定参考依据.

2.3.1 缓冲液浓度对辣木多酚的洗脱效果影响 以pH=4.0、10 mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液为过柱缓冲液，缓冲液浓度的分别为：10%、20%、30%柠檬酸-柠檬酸钠对辣木多酚的洗脱效果分别如图6a、图6b、图6c所示，当柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液浓度为20%时，各管的整体吸光度要优于另外两组，即各管中的多酚含量普遍较高.综合考虑：选择20%柠檬酸-柠檬酸钠作为缓冲液.

2.3.2 流速对辣木叶多酚的洗脱效果影响 以20%柠檬酸-柠檬酸钠为洗脱剂，上样量为10 mg，当洗脱流速分别为0.5 mL·min-1、1.0 mL·min-1时，辣木叶多酚的洗脱效果如图7 和图8 所示.由图可知，在0.5 mL·min-1的流速下洗脱效果最好.

2.3.3 上样量对葡聚糖凝胶分离效果的影响 以20%柠檬酸-柠檬酸钠为洗脱剂，洗脱流速为0.5 mL·min-1，当上样量分别为10 mg、20 mg时，研究上样量对葡聚糖凝胶分离纯化效果的影响，其分离效果如图9和图10所示.由图9和图10可知，当进样量为20 mg，多酚的分离效果最好.

3 结论

通过单因素得到酵母发酵破壁的最佳条件为：干性酵母添加量0.3%、辣木叶粉中加水量30 mL、发酵时间3 d、发酵温度32℃.同时该破壁法有效地改善了辣木叶粉原有的辣涩味，与未破壁的辣木叶粉比较，酵母发酵破壁法得到的可溶性多酚较多.Sephadex LH-20 凝胶柱层析分离纯化辣木叶多酚的工艺条件为：当以20%的酸化柠檬酸-柠檬酸钠为洗脱液，在0.5 mL·min-1的流速下进行洗脱，进样量为20 mg时，辣木多酚的分离效果最好.通过本文研究，以期为辣木中活性物质的进一步研发提供有利的依据.