核酸适体-胶体金体系检测氯霉素的研究

钟惠萍，黄巧娥，王 力

（集美大学 食品与生物工程学院，福建 厦门 361021）

氯霉素（ChlorChloramphenicol，CAP）能抑制细菌蛋白质的形成，是有效对抗多种革兰氏阳性、革兰氏阴性菌和多种厌氧生物的抗生素，因而被广泛用于人类和其他生物疾病的防治中.但研究表明其存在较严重的毒副作用，影响人的身体健康和畜水产品贸易，许多国家已严格禁止在食品动物饲养过程中使用，同时实施愈来愈严格的监控计划［1］.但由于其消毒效果良好，价格便宜，导致有些养殖者还在继续使用，因此，发展快速、灵敏检测技术、降低检出限成为氯霉素残留检测技术研究焦点［2］.核酸适体［3］是一种新型仿生生物识别元素，具有和抗体相媲美的亲和力和选择性，在食品安全领域，多种抗生素物质的核酸适体已被成功筛选和应用［4］.本研究利用可以特异性识别氯霉素分子的核酸适体作为识别元素，结合胶体金［5］团聚后吸光性质变化的现象对氯霉素进行检测.

1 实验部分

1.1 实验试剂

氯霉素、氯霉素核酸适体、柠檬酸钠、氯金酸、氯化钠、Tris.

1.2 实验方法

1.2.1 胶体金溶液的制备

将100 mL 0.4 g·L-1氯金酸溶液倒入圆底烧瓶中，用封口膜及橡胶圈将瓶口封住，水浴加热至沸腾，剧烈搅拌下快速加入10 mL10 g·L-1的柠檬酸三钠溶液.待溶液颜色由深紫色变成酒红色，继续搅拌10 min.将制备好的胶体金溶液冷却至室温，装于瓶中，用锡箔纸包裹，置于4 ℃冰箱中冷藏备用［6］.

1.2.2核酸适体溶液的配制

本实验所用氯霉素核酸适体碱基序列为：ACT TCA GTG AGT TGT CCC ACG GTC GGC GAG TCG GTG GTA G［7］.配制方法如下：取装有40 nmol氯霉素核酸适体的管子，开盖前先在4000 rmp离心5min，慢慢打开管盖，加入100 μL 的纯化水，使其浓度为400 μmol·L-1，盖上盖后涡旋使之充分混匀，放入-20 ℃储藏备用.

1.2.3 核酸适体包被胶体金制备

取1 mL上述合成的胶体金与1 μL氯霉素核酸适体溶液，室温下置于震荡器中混合1 h，在4 000 rmp离心20 min，取下层沉淀物分散于2 mL pH=7.4 的Tris-HCl 缓冲液中，得到氯霉素核酸适体包被的胶体金［8］.

1.2.4 氯霉素的检测

取上述氯霉素核酸适体包被的胶体金溶液2 mL，加入250 μL一定浓度的氯霉素溶液，混合均匀后在震荡器中反应15 min.然后慢慢加入250 μL 1 mol·L-1的氯化钠溶液，置于震荡器中混合15 min，用酶标仪扫描溶液在350-750 nm范围内的吸收光谱，比较520 nm以及620 nm处的吸光度变化值.

2 结果与讨论

2.1 胶体金-核酸适体体系检测氯霉素的有效性

图1是不同体系下胶体金紫外可见光谱图，从图中可以看出，在胶体金溶液中加入氯化钠时，胶体金团聚，520 nm 处吸光度降低，620 nm 处有新的吸收峰；当先加入核酸适体再加氯化钠时，620 nm 无吸收峰，与胶体金本身吸收曲线基本相同，说明适体包被胶体金后对胶体金起稳定分散作用［9］，使得胶体金在一定浓度氯化钠下不发生团聚；而当在上述体系中加入氯霉素时，620 nm处吸收峰明显加强，说明适体与氯霉素分子结合，胶体金失去保护，发生团聚.实验结果表明，核酸适体包被的胶体金检测方法可以用于氯霉素的检测中.

2.2 氯霉素检测标准曲线及灵敏度

在氯霉素核酸适体包被的胶体金溶液中加入不同浓度的氯霉素溶液，图2（a）显示，随着氯霉素浓度的增加，溶液在520 nm处的吸收峰强度逐渐降低，而620 nm处的吸收峰强度逐渐升高；图2（b）显示，在氯霉素浓度为10～50 μmol·L-1范围内，胶体金A620nm/A520nm比值与氯霉素的浓度呈现良好的线性关系，线性方程为：y=0.003x+0.279，相关系数R2=0.9904，检出限为3.76 μmol·L-1（3 σ/k，n=9）.

2.3 检测体系的选择性

为了考察检测体系的选择性，选取了五种氯霉素结构类似物及相关兽药进行了实验，分别是：呋喃西林（NF）、磺胺二甲基嘧啶（SMZ）、金霉素（CTC）、土霉素（OTC）、四环素（TC）.将每种样品配制成50 μmol·L-1的溶液，按氯霉素（CAP）的检测条件进行测定，在350-750 nm范围内扫描紫外可见吸收光谱，计算A620nm/A520nm.每种样品平行测定三次，表1结果分析显示样品测定值重复性较好，标准偏差均远小于平均值的10%.根据图3 可知，加入氯霉素结构类似物的吸光度比值A620nm/A520nm与空白值很接近，差值在0.03以内；而加入氯霉素的A620nm/A520nm值与空白值差值达到0.16.实验结果说明，这些结构类似物与氯霉素核酸适体的亲和力比较低，响应较小，氯霉素核酸适体可以选择性结合氯霉素分子，因此氯霉素核酸适体包被的胶体金检测方法可以用于氯霉素的特异性检测中.

表1 氯霉素及其结构类似物吸光度比值A620 nm/A520 nmTab.1 Absorbance ratio A620 nm/A520nm of CAP and its analogues

3 结论

基于氯霉素核酸适体和胶体金建立了一种检测氯霉素的方法，方法具有高灵敏度和高选择性.该法简便易行，满足样品现场、快速的检测需求.