辣椒雄性不育分子标记研究进展

程 翔 汤冰倩 刘 峰 马艳青

（1.湖南大学研究生院隆平分院， 长沙 410125； 2.湖南农业大学， 长沙 410128； 3.湖南省农业农村厅， 长沙 410005）

辣椒具备强杂种优势，杂交后代可明显改善果实品质，增加经济产量，并且显著提高辣椒抗病和耐贮性状。辣椒杂交育种在20 世纪90 年代便已推广，但人工去雄耗费大量人力，且种子纯度无法保证。因此利用雄性不育系育种成为辣椒新品种选育的重要方式之一。开展辣椒雄性不育系选育，进行辣椒杂种优势利用及杂种技术应用研究受到科研工作者的重视。近年来，形态特征与生理生化层面的雄性不育有关研究已经取得了一系列的成果，随着分子技术的进步和仪器水平的提高，分子标记辅助育种已经成为辣椒育种的重要方向。

1 雄性不育

雄性不育性状受环境和遗传因素共同调控，可以通过人工选育出不育性状稳定的雄性不育系（sterility line）。雄性不育材料主要通过自然突变、远缘杂交、人工诱变等途径获得。植物界的雄性不育表现非常复杂，败育时期也不相同。雄性不育按基因型可分为细胞核不育型和细胞质不育型两大类。细胞核雄性不育（GMS）分为显性核不育和隐性核不育，受细胞核基因控制。细胞质雄性不育型（CMS）受细胞质和细胞核基因共同控制，可以被显性核恢复（restorerfactor，Rf）基因恢复育性，所以细胞质雄性不育型也为核质互作型。通过筛选细胞质雄性不育型的保持系与恢复系，实现“三系配套”，对生产实践具有重大意义[1-2]。

杂交种已在辣椒生产上占据了主导地位，主推品种均为一代杂种。在杂交制种与选育时需要去雄授粉，效率低。近年来由于劳动力价格的不断攀升与对杂交种稳定性的需要，辣椒雄性不育基础研究与实践应用备受关注。利用辣椒雄性不育系制种可以明显降低成本，保证纯度，同时促进知识产权的保护。据张锐等[3]统计，已经报道的从事辣椒雄性不育研究的科研单位有三十余家。自20 世纪90 年代以来，利用雄性不育系育种，已经选育出一批市场竞争力强、抗病虫、耐运储的新品种。新品种的选育与推广带来了巨大的经济效益与社会效益，其中一些科研单位影响力较大。国内，沈阳市农业科学院杨世周[4]在1978 年首先发现辣椒雄性不育现象,之后选育出一批辣椒雄性不育两用系。沈阳市农业科学院杨凤梅等[5-6]利用核不育材料AB14-12 成功选育出沈椒系列与沈研系列辣椒品种，其中代表品种“沈研14 号”熟性早，连续坐果能力极强，且在抗逆性方面表现优异。河北省农林科学院蔬菜花卉研究所范妍芹等[7-8]通过不育系AB91-8 选育出冀研系列品种，其中代表品种“冀研8 号”商品性好，抗病毒病，在生产中大面积推广。北京市农林科学院蔬菜研究所耿三省等[9]通过辣椒胞质雄性不育材料181A 选育出高抗TMV 的“京辣2 号”，且适于全国各地露地栽培。湖南省蔬菜研究所邹学校等[10-11]选育了我国第一个通过审定的辣椒核质互作雄性不育系9704A，成功实现了三系配套，在此基础上育成湘研系列与湘辣系列品种，其中代表品种“湘辣1 号”味辣质脆，满足嗜辣地区市场需求，另一代表品种“湘研14 号”也带来了良好的社会效益。中国农业大学沈火林等[12]以胞质不育材料S200243A 为母本选育出微辣而果肉脆嫩的“农大082”，并在多地示范推广。江苏省农业科学院赵华仑等[13]采用CMS 三系配套法选育出高产稳产的“苏椒3号”，并在生产上大面积推广。据王立浩等[14]统计，“十二五”期间，选育出一批稳定的辣（甜）椒雄性不育两用系和辣椒细胞质雄性不育恢复系。这些雄性不育系的选育为优良品种创制打下了坚实的基础。

2 分子标记技术

分子标记是直接反映DNA 水平遗传多态性的新型标记。相对于形态、细胞和生化标记，分子标记不仅在任何发育时期及各个部位均可检测，而且标记数量极多。第一代分子标记技术以分子杂交为基础，有RFLP（限制性片段长度多态性标记）；第二代以聚合酶链式反应为核心，有RAPD（随机扩增多态性标记）、AFLP（扩增片段长度多态性标记）、SSR（微卫星重复序列）；第三代以DNA 已知特定序列为基础的技术，有SNP（单核苷酸多态性）、InDel（插入缺失标记）、EST（表达序列标签）。其中SSR 标记因其稳定性好，成本较低，目前应用最为广泛。InDel 在DNA 中分布密度大于SSR，具有与SSR 相似的共显性好及相对稳定的优点。SNP 为单个碱基的差异，在基因组中分布最广泛，但其成本较高。随着测序技术的发展，InDel 标记与SNP 标记已经逐渐应用于基因定位和分子标记育种领域。分子标记辅助育种可以定向改良作物性状，加快育种进程,相对于传统育种具有较强的优越性。吴俊等[15]利用分子标记辅助选择技术，育成了两系杂交中稻新组合Y两优7 号，超高产条件下产量达12 t/hm2，产量增加显著。周屹峰等[16]通过分子辅助育种技术，培育出低直链淀粉含量的不育系浙农3A，有效改良了稻米品质。除此之外，遗传多样性分析、图谱构建、QTL 定位、基因克隆和基因的表达调控等研究都离不开分子标记技术。

3 辣椒雄性不育分子标记的研究进展

在过去的二十年间，雄性不育相关基因研究取得了阶段性的进展，相当数量的分子标记被开发。相对于水稻、番茄等作物，辣椒基础研究相对滞后，辣椒基因组信息于2014 年才公布。辣椒遗传群体多态性低也限制了标记开发进程，从而实用标记不足成为应用的瓶颈。在知网上以“分子标记辅助育种研究进展”为关键词进行搜索，可查阅到大豆、小麦、水稻等作物有一定数量的文献，但分子标记辅助育种技术在辣椒领域的应用相对较少，目前未有系统报道。与“导入外源基因”的转基因不同，分子标记辅助选择技术是在充分地发挥了种内基因多态性的资源。这不仅能够将过去难以着手的优良数量性状进行整合，还规避了安全隐患问题与社会道德伦理的问题，对辣椒产业具有重大意义，会成为未来育种趋势。随着辣椒基因组信息公布，大量标记的开发成为可能。当前开发的标记中SSR 标记和Indel 分子标记较多，随着技术与设备的发展，SNP 标记开发会逐渐走向成熟，为辣椒分子标记辅助育种提供保障。

3.1 辣椒核雄性不育分子标记的研究进展

3.1.1 国内辣椒核雄性不育分子标记的研究进展

GMS 受细胞核内一对基因控制，相对于CMS，两系配套选育过程复杂，但恢复资源多。据Dhaliwal等[17]统计，在辣椒中约20 个独立遗传的核不育系基因已被发现，但国内开发出的相关基因分子标记并不多。孟雅宁等[18]运用BSA 法与全基因组重测序技术，以甜椒细胞核雄性不育两用系AB91 为材料，开发了2 个标记，经鉴定AB91 核不育基因与甜椒核雄性不育基因连锁的位点标记为H12、H24，与不育基因msms 的连锁距离分别为0.29 cM、0.00 cM，为进一步克隆甜椒核雄性不育基因提供了理论依据。李国琴等[19]采用cDNA-AFLP 方法，从辣椒雄性不育两用系HW58 的可育株花蕾与不育株花蕾中获得阳性差异TDF，通过电子克隆获得865 bp 的cDNA 序列，其与烟草CP26 基因序列的同源性高达90%，并命名为CaCP26。严慧玲等[20]以甜椒细胞核雄性不育两用系AB91 为材料，筛选了225对SRAP 引物组合及1 393 对EcoR Ⅰ和Mse Ⅰ引物组合，确定了标记 E37M39（200 bp）与育性基因的遗传距离6 cM 和标记E44M93（500 bp）与育性基因的遗传距离12 cM。程青等[21]通过重测序，确定Capana02g002096 为强候选基因，开发一个名为Indel-12 的Indel 标记，与msc1 基因连锁，通过基因鉴定确认，标记Indel-12 与msc1 位点在所有群体中共分离。

3.1.2 国外辣椒核雄性不育基因分子标记的研究进展 目前利用的辣椒核不育分子标记较多为国外研究人员所开发，但也仅ms1、ms3、ms8 和ms10 基因有定位进展报道。Lee 等[22-24]开发了一个与ms1 基因连锁的SCAR 标记。筛选出1 个扩增514 bp 片段的AFLP 标记E-AGC/M-GTG，通过对比分析，开发出了一种共显性MS1-SCAR 标记。此外，确定了3 个与ms3 基因紧密连锁的AFLP 标记（Eagg/Mccc276、Eagc/Mctt178 和Ecag/Mtgc204），并 将AFLP 标 记Ecag/Mtgc204 转 化CAPS 标 记GMS3-CAPS。之后还开发了1 个与msk 基因连锁的GMSK-CAPS 标记，其研究在辣椒雄性不育领域较为深入。共分离标记可以有效提高辣椒分子标记辅助育种的准确度。Jeong 等[25]首次精细定位辣椒核不育基因。其开发出的HRM 标记（32187928-HRM）与表型共分离，通过精确定位与功能预测，发现雄性不育的发生可能与CA05g06780 基因功能障碍有关。Heung-Ryul Lee[26]利用BSA 和AFLP开发了1 个AFLP 标记，之后扩增并重新设计引物进行高分辨率熔解曲线分析（HRM），开发出1个与甜椒中新不育源连锁的GMSE 标记。Aulakh 等[27]将ms10 基因定位于1 号染色体上，并开发了与其连锁的SSR 标记AVRDC-PP12 和AVRDC_MD997，与ms10 位点的连锁距离分别为7.2 cM 和 20.8 cM。Bartoszewski 等[28]通过RAPD-BSA 技术，鉴定了7 个与ms8 位点相关的标记，将ms8 定位在了第4 号染色体上，并开发了与ms8 基因连锁的2个标记SCAR-P2 和RAPD Z05-760，遗传距离分别为34.5 cM 与4.6 cM。这些标记为将来育种应用打下了坚实基础。

Naresh 等[29]通过序列分析鉴定SNP 标记，之后采用BSA 方法，在1 号染色体上鉴定出4 个与ms3 基因共分离的SNPs，且在5 号染色体上鉴定出1 个与msw 基因共分离的SNPs。开发了2 个与ms3基因相关的标记，分别命名为HPGMS2（CAPS）和HPGMS3（dCAPS）。同时开发了与msw 基因相关的dCAPS 标记（SPGMS1）。经检测确认，这些标记可以应用于苗期鉴定核不育单株，从而推动杂交种生产。

3.2 辣椒胞质雄性不育分子标记的研究进展

3.2.1 国内辣椒胞质雄性不育分子标记的研究进展

目前雄性不育研究中，胞质雄性不育分子标记相对较多，且应用更加广泛。鉴定出材料的细胞质类型，在整个辣椒胞质雄性不育三系杂交系统中是非常重要的一环。采用分子标记鉴定细胞质类型，更有目的地配制杂交组合，可以减少工作量，特别对保持系的选育意义重大。叶青静等[30]以胞质雄性不育系131BC5A 与恢复系139D-21-3 材料,采用 CAPS、SSR 及SCAR 方法，构建包含210 个F2单株的定位群体，开发出连锁标记14 个，有利于分子标记辅助育种的应用。魏兵强等[31]利用近等基因系原理和 RAPD 标记技术获得BH19-S900，并将其转化为共显性的SCAR 标记SS730，还获得不育保持基因标记H7F850，并转化为SCAR 标记SF640，有利于分子标记鉴定不育系的推进。张强 等[32]根据细胞质育性标记SCAR130 的序列多态性位点设计KASP 标记引物，使其转化为KASP130分子标记。KASP 标记适用于高通量检测，有利于提高不育系和保持系选择效率。张正海等[33]研究中发现了1 个新的辣椒细胞质雄性不育恢复候选基因CA00g82510（CM334，Capsicum annuum L.），并利用CA00g82510 在亲本间差异 SNP 位点开发了5 个多态性KASP 标记。王鹏等[34]通过比较线粒体基因组，认为orf300a 和orf314a 是不育系138A中控制不育的强候选基因，并开发了1 个与不育共分离的标记orf300a。杨娟等[35]首次采用SSR 标记手段进行辣椒恢复基因定位，成功将恢复基因定位在第6 号染色体上，通过175 对SSR 引物筛选材料，发现AF208834 与恢复基因连锁且遗传距离为20.8 cM。并首次结合SSR 标记与SCAR 标记，可显著提高辣椒雄性不育系恢复系的选择效率。李怡斐 等[36]筛选出3 个与Rf 基因紧密连锁的分子标记，分别为CRF-SCAR、PR-CAPS 和OPP13-CAPS，并对CRF-SCAR 标记进行验证,结果表明育种实际应用中可以利用标记CRF-SCAR 筛选含恢复基因材料，对提升育种效率有显著帮助。

3.2.2 国外辣椒胞质雄性不育分子标记的研究进展

部分国外研究者在辣椒胞质雄性不育分子标记领域研究成果较为系统与深入，为辣椒雄性不育系的分子标记辅助选择育种提供了理论参考。Jo等[37-38]开发出1 个标记accD-U，用此标记对不育系与保持系筛选，发现仅在不育系中扩增出片段，应用性较强。之后运用BSA-AFLP 技术，在与Rf 位点共分离的基因组区域中发现了1 个强候选恢复基因，编码PPR 蛋白的CaPPR6，为首个细胞核内分离并克隆的Rf 基因。与此同时开发出1 个最接近此基因的共显性分子标记Co1Mod1-CAPS，此标记适用性强，有利于推动辣椒育种的应用。Lee 等[39]采 用 BSA-AFLP 方法以87 株F2单株为定位群体，筛选到2 个与部分恢复基因pr 紧密连锁的多态标记E-AGC/MGCA122 和E-TCT /M-CCG116。并将E-AGC/MGCA122 转化成1 个应用于辣椒育性筛选的PR-CAPS 标记，其遗传距离为1.8 cM。苗期对植株进行恢复基因的鉴定可减少测交工作量，缩短恢复系的选育时间，提高选择效率的同时加速恢复基因精细定位与克隆。

为了构建遗传图谱，Min 等[40]以“Buja”和“Tamna”的F2群体为材料，构建了Rf-BSA、rf-BSA 和4 个重组子池，用于AFLP 标记分析，鉴定并筛选出3 个Rf 连锁分子标记AFRF1、AFRF3 和AFRF4。在甜椒方面，Mulyantoro 等[41]利用 CMS 相关标记，首次将甜椒 NMS 转化为CMS，为提高甜椒杂交制种产量奠定基础。Kim 等[42]利用2 个 RAPD 标记 OP131400（0.37 cM）、OW18800（8.12 cM）和1 个CAPS 标记AFRF8CAPS（1.8 cM）对Rf 基因进行了定位。之后 Kim 等[43]发现的apt6 和orf456 基因为辣椒雄性不育的强候选基因。orf456 为coxII 基因的3'端的线粒体新开放阅读框，在不育系中高表达，但在恢复系中该蛋白的表达水平明显降低。通过农杆菌介导法将该基因导入拟南芥，发现转化群体有45%表现为雄性不育，有力证明orf456 是不育强候选基因，同时可以用来鉴定辣椒胞质不育的不育表型。

4 展望

在核雄性不育系研究中，重点在于开发紧密连锁的标记，依靠分子标记辅助培育核雄性不育系可避免传统回交繁杂且耗时长的缺点。在胞质雄性不育系研究中，由于恢复基因资源少，选育周期长，细胞质雄性不育恢复系的选育一直是三系配套的难点，这个问题在甜椒中尤为突出。分子标记的开发有望解决这一困难，通过紧密连锁恢复基因的分子标记进行快速筛选，减少传统测交工作量。细胞质雄性不育系的应用因相关基因的标记逐步开发与恢复基因的定位，使得更多“三系配套”的开发与应用成为可能。但目前报道的一些标记存在数量较少与连锁距离较远等问题，还需要进一步开发出便于应用且连锁紧密的分子标记。随着辣椒基因组和线粒体基因组的公布，将加速相关基因紧密连锁遗传图谱的构建、不育相关标记的克隆开发与恢复主效基因的转育，进一步利用基因工程技术，构建全新雄性不育系用于辣椒的杂种优势。