中药复方对鲫鱼细菌性败血症的防治效果
2020-03-17田海军郑曙明
田海军,郑曙明
中药复方对鲫鱼细菌性败血症的防治效果
田海军1,郑曙明2
(1. 信阳农林学院,河南 信阳 464000,2. 西南大学动物科技学院,重庆 402460)
【】研究中药复方对鲫鱼()细菌性败血症的防治效果。由茵陈、地锦草、大黄、黄芩、白术、苦参、板蓝根按一定比例组成中草药复方,用索氏提取法以乙醇为溶剂提取中草药复方的总有效成分,提取物按质量分数0%、0.5%、2.0%,中药复方原料粗粉按质量分数2.0%的添加量制成药饵(分别记为0%、0.5%、2.0%药饵组,2.0%生药组),投喂人工感染温和气单胞菌()的鲫鱼,测定感染4 d和15 d时鲫鱼的血清转氨酶(GPT、AST)、甘油三酯(TRIG)、胆固醇(TC)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、白球比(白蛋白与球蛋白质量浓度比,A/G)等肝功能指标,尿素氮(BUN)、尿酸(UA)、肌酐(CR)等肾功能指标,心肌功能指标肌酸磷酸激酶(CPK)。2.0%药饵组在0.5×109cfu/mL和1×109cfu/mL的温和气单胞菌攻毒感染下,药饵防治率分别为82.5%和42.5%,与0%药饵组相比,药效极显著(< 0.01)。相对于对照组(健康鱼),感染0.5×109cfu/mL 温和气单胞菌病鱼(0%药饵组)转氨酶、TRIG、TC、TP、ALB、GLB、A/G指标下降(< 0.05),BUN、UA、CR、CPK指标上升(< 0.05),而其他药饵组各指标均较0%药饵组改善,恢复至对照组水平。中药复方对鲫鱼细菌性败血症有一定防治作用,可改善病鱼的肝脏、肾、心肌功能的受损状态。以添加质量分数2%中草药复方提取物的药饵防治鲫鱼细菌性败血症的药效显著。
鲫鱼;细菌性败血症;血液生化指标;中药复方;药效学
细菌性败血症是危害水产养殖的主要疾病之一,为暴发性流行病,其危害最重,流行区域广,流行周期最长,几乎可殃及所有的淡水鱼类,患病鱼从出现症状到暴发性死亡仅3 ~ 5 d,死亡率高达95%以上,每年因鱼类细菌性败血症造成的经济损失高达几亿元[1]。目前用于防治鱼类细菌性败血症的药物主要是抗生素、消毒剂等化学药物,然而化学渔药的大量使用会影响水体的生态平衡,导致耐药性病原菌产生,因此急需开发纯天然、疗效好、无药物残留的中草药制剂,以防控水产养殖生产中的水产动物细菌性败血症。用中药防治鱼类病害,成本低廉、绿色环保、无药品残留等,符合无公害养殖要求[2]。且实践证明,作为免疫增强剂,中草药有利于水产养殖鱼类病害的群体防治。对于中草药药饵防治水产动物细菌性败血症仅见于陈学年等[3-8]的中草药生药粉末药饵防治鲫鱼败血病的试验,有关复方提取物对鱼类细菌性败血症的药效试验还有待进一步研究。
本课题组依据中医药理论及水产动物医学理论,通过琼脂–孔洞扩散法药敏试验及药饵防治试验筛选出对细菌性败血症病原菌抑菌效果较佳,由茵陈、地锦草、大黄、黄芩、白术、苦参、板蓝根按一定比例组成的中草药复方[9]。笔者测定健康鲫鱼经攻毒感染细菌性败血症后的血液生化指标,建立鲫鱼细菌性败血症血液生化病理模型,通过药饵对病鱼肝、肾、心肌功能以及造血功能的恢复作用研究该中草药复方的药效,为鱼病防治药物开发和水产养殖生产奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验鱼 信阳市水产科学研究所提供健康鲫(),规格均匀,体质量(40±0.5)g。
1.1.2 试验用菌液 试验致病菌温和气单胞菌()病株XSKS-2由信阳农林学院微生物实验室提供,分离自信阳市水产科学研究所养殖场有典型细菌性败血症症状的鲫鱼。通过病株对健康鲫鱼的回归感染试验,确定温和气单胞菌的感染剂量。
1.1.3 药饵 复方中草药由下列中药原料按质量分数配制:茵陈18% ~ 22%,地锦草18% ~ 22%,大黄18% ~ 22%,黄芩8% ~ 12%,白术8% ~ 12%、苦参8% ~ 12%,板蓝根8% ~ 12%。复方中七味中草药原药购自信阳市仲景大药房,用超微粉碎机(15 kW)粉碎成原药粗粉。用索氏提取器以乙醇为溶剂连续回流提取复方中草药,提取物分别按质量分数0%、0.5%、2.0%添加量均匀喷洒在饲料上制成药饵(即0%、0.5%、2.0%药饵组),另外用复方原料粗粉按质量分数2.0%的添加量制成药饵(2.0%生药组)。
1.1.4 养殖池 1.2 m × 0.6 m × 0.8 m玻璃缸,不间断充氧,水温(23.0±0.5)℃,每天换水量不超过1/3。
1.2 方法
1.2.1 试验设计 根据预试验,细菌攻毒试验选取0.5×109、1.0×109cfu/mL两个浓度梯度(预试验攻毒感染发病率为55% ~ 85%),药饵防治试验设0%、0.5%、2.0%药饵组及2.0%生药组,即并设空白对照组(健康鲫鱼,未进行人工攻毒感染,投喂普通饲料),共9个试验组(表1),每试验组设2平行组, 1组用于药饵防治率试验,另1组用于血液生化指标测定取样。每组试验鱼40尾,试验前健康鲫鱼先暂养2周,再投喂药饵1周,然后各试验组腹腔注射相应浓度的温和气单胞菌菌悬液进行攻毒感染试验。
1.2.2 药饵防治率 发病后每d记录各试验组鱼存活数,连续记录1周。存活率及药饵防治率结果采用方差分析和检验。
表1 试验区组设计
1.2.3 血液生化指标测定 人工感染后4 d(细菌性败血症暴发高峰期)、15 d(细菌性败血症病程稳定期)时取1至4组试验组及对照组共计5组,每组取鱼6尾进行尾静脉采血。用URIT-3000PLUS 全自动血细胞分析仪检测血清谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(AST)、甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、白球比(A/G)、尿素氮(BUN)、尿酸(UA)、肌酐(CR)、间接胆红素(IBIL)、肌酸磷酸激酶(CPK)等血液生化指标[9]。
2 结果与分析
2.1 不同细菌浓度攻毒感染下各药饵组试验鱼的存活率
在菌液浓度为0.5×109cfu/mL时,2.0%药饵组鲫鱼存活率最高,添加质量分数2.0%复方提取物的药饵对鲫鱼存活率为82.5%;其次为2.0%生药组,鲫鱼存活率为77.5%。在菌液浓度1×109cfu/mL时,2.0%药饵组鲫鱼存活率最高,为42.5%;其次为2.0%生药组,鲫鱼存活率为37.5%(表2)。
经过检验及方差分析,在0.5×109cfu/mL及1.0×109cfu/mL菌液浓度下,2.0%药饵组和2.0%生药组与0%组差异有统计学意义(< 0.01),0.5%药饵组与0%药饵组、2.0%药饵组和2.0%生药组之间差异无统计学意义。总体而言,在两种浓度菌液感染下,质量分数2%的复方提取物的药效均有统计学意义(< 0.01)。
表2 不同药饵浓度和不同细菌浓度时患病鱼的死亡情况
2.2 血液生化指标测定结果
血液生化指标中反映肝脏功能状态的有转氨酶、甘油三酯、胆固醇、血清总蛋白、血清白蛋白、血清球蛋白等,当肝脏细胞受到损伤时血清转氨酶升高,其他指标下降[10-14]。感染4 d时0%药饵组(感染细菌性败血症的病鱼)谷丙转氨酶活性较对照组(健康鲫鱼)显著下降(< 0.05),其他药饵组谷丙转氨酶活性与对照组差异无统计学意义(> 0.05),但高于0%药饵组(< 0.05)。感染15 d时各药饵组测定值与对照组相近(> 0.05)(图1)。
图2可见,感染4 d时,各组间谷草转氨酶活性差异均无统计学意义(> 0.05),仅0%药饵组较对照组有下降趋势;感染15 d时,各组间谷草转氨酶活性差异均无统计学意义(> 0.05),仅0%药饵组较对照组有上升趋势。
图3可见,感染4 d时,0%、0.5%药饵组血清胆固醇低于对照组(< 0.05),2%药饵组和生药2%组与对照组差异无统计学意义(> 0.05);感染15 d时,0%药饵组血清胆固醇比对照组显著下降(< 0.05),其他药饵组与对照组差异无统计学意义(> 0.05)。
凡含相同字母者表示组间差异无统计学意义(P > 0.05)
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Fig.3 Serum cholesterol levels in serum 4 and 15 d after injection
图4可见,感染4 d时,0%药饵组甘油三酯比对照组下降(< 0.05),2%药饵组和生药2%组高于0%药饵组(< 0.05),但与对照组无显著差异 (> 0.05);感染15 d时0%药饵组甘油三酯比对照组下降(< 0.05),其他药饵组高于0%药饵组(< 0.05),与对照组测定值接近(> 0.05)。
凡含相同字母者表示组间差异无统计学意义(P > 0.05)
图5可见,感染4 d时,0%药饵组血清总蛋白比对照组显著下降(< 0.05),其他药饵组高于0%药饵组(< 0.05),与对照组差异无统计学意义(> 0.05);感染15 d时,所有实验组无显著差异(> 0.05)。
凡含相同字母者表示组间差异无统计学意义(P > 0.05)
图6可见,感染4 d、15 d时,各试验组的血清白蛋白变化一致,均表现为0%药饵组比对照组显著下降(< 0.05),其他药饵组高于0%药饵组(< 0.05),但与对照组差异无统计学意义(> 0.05)。
图7可见,感染4 d、15 d时,各试验组的血清球蛋白变化一致,均表现为0%药饵组比对照组显著下降(< 0.05),其他药饵组高于0%药饵组(< 0.05),但与对照组差异无统计学意义(> 0.05)。
凡含相同字母者表示组间差异无统计学意义(P > 0.05)
凡含相同字母者表示组间差异无统计学意义(P > 0.05)
Fig .7 Serum globulin concentrations in serum 4 and 15 d after injection
图8可见,感染4 d时,0%药饵组血清白球比(白蛋白和球蛋白的质量浓度比值)比对照显著下降(< 0.05),其他药饵组高于0%组(< 0.05),但与对照组差异无统计学意义(> 0.05);感染15 d时,0%药饵组比对照组显著下降(< 0.05),其他药饵组高于0%药饵组(< 0.05),但与对照组差异无统计学意义(> 0.05)。
图9可见,感染4 d、15 d时,各试验组血清肌酐变化一致,均表现为0%药饵组血清肌酐高于对照组及其他药饵组(< 0.05),但其他各组间差异无统计学意义(> 0.05)。
图10可见,感染4 d、15 d时,0%药饵组血清尿素氮浓度比对照组及其他药饵组显著上升(< 0.05),其他药饵组与对照组差异无统计学意义(> 0.05)。
凡含相同字母者表示组间差异无统计学意义(P > 0.05)
凡含相同字母者表示组间差异无统计学意义(P > 0.05)
凡含相同字母者表示组间差异无统计学意义(> 0.05)
The data with a same letter means no significant difference (> 0.05)
图10 感染4、15 d时血清尿素氮浓度
Fig.10 Serum urea nitrogen concentration in serum 4 and 15 d after injection
图11可见,感染4 d、15 d时,0%药饵组血清尿酸比对照组及其他药饵组显著上升(< 0.05),其他药饵组与对照组差异无统计学意义(> 0.05)。
凡含相同字母者表示组间差异无统计学意义(P > 0.05)
由图12可见,感染4、15 d时,0%药饵组血清间接胆红素(造血功能指标)均比对照组及其他药饵组显著上升(< 0.05),其他药饵组与对照组差异无统计学意义(> 0.05)。
凡含相同字母者表示组间差异无统计学意义(P > 0.05)
由图13可见,感染4 d、15 d时,0%药饵组肌酸磷酸激酶(心肌功能指标)比对照组及其他药饵组显著升高(< 0.05),其他药饵组与对照组差异无统计学意义(> 0.05)。
凡含相同字母者表示组间差异无统计学意义(P > 0.05)
3 讨论
3.1 复方配伍机制及药理作用
复方中草药是以茵陈、黄芩为君药,茵陈黄芩作为基础方有清热利湿、利胆、保护肝功能,解热,抗炎,改善微循环,并有抗凝血及抑制多种致病性细菌的作用。以大黄、地锦草、板蓝根为臣药,大黄泻下攻积、清泄湿热,板蓝根抗菌消炎,地锦草凉血化瘀止血,三味臣药配伍可利水通淋,促进细菌内毒素排出。以苦参、白术为佐药,苦参甘平,可健脾益气,白术燥湿健脾。两味佐药有提高机体免疫力,促进机体恢复的功效。
作用机理:1)抗炎,复方总黄酮成分可通过抑制一氧化氮合酶,减少毛细血管内皮细胞释放一氧化氮,调节花生四烯酸的代谢,抑制前列腺素E2 (PGE2) 和白三烯(LTC4) 的合成,其中以黄芩素和黄芩甙作用最强[15-16]。2)杀菌解毒,复方中的黄酮、蒽醌、有机酸等有效成分有强烈的抑菌作用,对消除细菌毒素对组织的损伤效果较佳[17-18]。黃芩有清热解毒作用,通过降低脑脊液cAMP含量而拮抗内毒素致热活性,黄芩的抗自由基作用是通过提高线粒体、溶酶体等内源性超氧化物歧化酶、琥珀酸脱氢酶等酶的活性而加速清除的,地锦草、黄酮也有清除和抑制羟基自由基的作用,黄芩地锦草还有止血、改善血管微循环,直接破坏内毒素的作用[19-20]。
3.2 复方中草药对病鱼肝脏功能的影响
鱼类在感染细菌后,血液生化指标会发生相应改变,血清转氨酶、甘油三酯、胆固醇、总蛋白、白蛋白、球蛋白、白球比等生化指标可反映肝脏的功能状态,当肝脏受到病原等因素的损伤时血清转氨酶会升高,其他指标会下降。本研究中,鲫鱼患细菌性败血病(0%药饵组)4 d时,转氨酶下降,甘油三酯、胆固醇、血清总蛋白、血清白蛋白、血清球蛋白等其他肝功能指标下降,表明温和气单胞菌感染亦造成鱼体肝功能改变。齐口裂腹鱼()感染嗜水气单胞菌()后,血清中谷草转氨酶、总蛋白、球蛋白和甘油三酯含量与对照组均无差异显著性,但总蛋白和球蛋白在攻毒后4 h时最低,之后有逐渐升高趋势,而甘油三脂则随着时间的延长有逐渐降低趋势[21],与本研究结果不尽一致。本研究血清转氨酶下降的原因可能是由病鱼严重的充血、出血、溶血所致;血清中甘油三酯、胆固醇、血清总蛋白、血清白蛋白、血清球蛋白等下降说明病鱼肝脏损伤、合成功能下降;血清总蛋白、血清白蛋白、血清球蛋白和鱼类免疫功能有关,说明鲫鱼患细菌性败血症后免疫机能降低。与0%药饵组相比,投喂药饵组转氨酶下降趋势减缓,血清甘油三酯、胆固醇、总蛋白、白蛋白、球蛋白等与对照组的健康鲫鱼测定值无显著差异,说明中草药复方药饵改变了病鱼转氨酶的变化,促进了转氨酶指标的恢复,说明药饵改善了肝组织的炎症损伤,使肝功能恢复到接近健康鲫鱼(对照组)水平。
鱼类细菌性败血症的病理模型可描述为:温和气单胞菌侵入鱼体后,先在肠道内增殖,再经门动脉循环进入肝脏、肾脏及其他组织,引起肝脏、肾脏等器官以及血液病变,继而出现全身症状[23]。本研究的复方中草药有保护鱼类肝功能,抗炎,改善微循环,并有抗凝血及抑制多种致病菌的作用,促进了患细菌性败血症鲫鱼肝功能的恢复。
3.3 复方中草药对病鱼肾脏功能的影响
尿素氮、尿酸、肌酐是蛋白质代谢产物,血液中尿素氮、尿酸和肌酐的浓度间接地反映肾脏的排泄功能,肾功能下降时,血清尿素氮、尿酸、肌酐指标会升高[24]。米瑞芙[25]研究表明,鲢()患败血病后尿素、尿酸、肌酐显著增加。庞启华等[22]研究表明,人工感染豚鼠气单胞菌 () CSS42菌株的丰产鲫尿酸浓度显著升高,表明病鱼肾功能出现障碍。本研究中感染4、15 d的病鱼(0%药饵组)血清尿素氮、尿酸、肌酐比对照组(健康鱼)及其他药饵组显著上升,说明病鱼肾功能受损;其他药饵组与对照组差异无统计学意义,说明药饵改善了病鱼肾脏的受损状态,使药饵组病鱼的肾功能恢复至正常水平。
3.4 复方中草药对病鱼造血功能的影响
间接胆红素(IBIL)主要由红细胞破坏而来,当体内红细胞被大量破坏,产生大量的间接胆红素,则超过肝脏代偿能力,血中间接胆红素含量升高,是造血功能和肝胆疾病的一个检测指标[11]。鲢()患败血病后血清胆红素显著增加[25]。本研究中,与对照组(健康鱼)相比,感染后的病鱼(0%药饵组)间接胆红素显著升高,这与病鱼造血组织和肝脏的病变有关,当温和气单胞菌侵袭造血组织(器官),引起溶血,体内红细胞大量破坏,产生大量的间接胆红素,超过肝脏代偿能力。各药饵组病鱼间接胆红素与0%药饵组相比较则下降,且与对照组健康鱼无显著性差异,这是因为,复方中的黄芩、地锦草成分有止血、改善血管微循环,减轻了细菌对造血组织(器官)的损伤。
3.5 复方中草药对病鱼心肌功能的影响
鱼类多种细胞均含有肌酸磷酸激酶,但仅心肌和骨骼肌的肌酸磷酸激酶含量能改变血清中肌酸磷酸激酶的含量。当心肌细胞受损或通透性增高时,则将该酶释放到血液中,骨骼肌严重出血,肌纤维的变性、坏死及明显的病理改变也是血清肌酸磷酸激酶升高的原因。患有细菌性败血症的病鱼未见骨骼肌出血现象,因此,罹患该病病鱼肌酸磷酸激酶升高则由心肌功能受损所致。本研究中,感染温和气单胞菌的病鱼肌酸磷酸激酶指标显著上升,因此,病鱼心肌功能受损,投喂药饵的病鱼与0%药饵组比较,肌酸磷酸激酶指标下降,且与对照组健康鱼血清肌酸磷酸激酶测定值无显著性差异,表明药饵改善了心肌的受损状态。
由温和气单胞菌、嗜水气单胞菌等细菌性感染的病鱼,其血液生理生化指标数均有显著改变,但具体指标究竟是增加还是减少,文献报道不一致。鲢鱼患败血病后肌酸磷酸激酶显著增加[25],感染豚鼠气单胞菌的丰产鲫肌酸激酶活性极显著降低(< 0.01),病鱼心肌功能出现障碍[22]。史成银等[26]认为,这可能与疾病的病程有关,并在Klontz等[27]研究中也有类似报道。本研究发现,健康鲫鱼感染细菌性败血症后,病鱼血液生化指标的变化与鲢鱼患败血病后血液生化指标变化[25 ]类似。但究竟是不是患细菌性败血症病鱼血液生化指标变化的普遍现象,还有待更进一步研究。目前缺乏健康鲫及患病鱼血液生理生化指标长期监测数据支撑,更需建立鱼类细菌性败血症病理生理模型[28-32],这是一项长期的任务。
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TIAN Hai-jun1, ZHENG Shu-ming2
(1.,464000,; 2.,,402460,)
To study the prevention and treatment effect of the Chinese herbal compound on bacterial septicemia of crucian carp,.Chinese herbal medicine mix from herba artemisiae, euphorbia humifusa atractylodes, radix et rhizoma rhei, radix scutellaria, ginseng, radix isatidis were prepared, and the total effective components of Chinese herbal medicine compound was prepared by soxhlet extraction method using ethanol as solvent. The extract was prepared by mass fraction 0%, 0.5% and 2.0%, and the raw material of the compound was prepared by mass fraction 2.0% (recorded as 0%, 0.5%, 2.0% of the bait group and 2.0% of the crude drug group, respectively). Crucian carp were artificially infected with, and infection was evaluated at day 4 and day 15. Serum biochemical parameter including transaminase (GPT, AST), triglyceride (TRIG), cholesterol (TC), total protein (TP), albumin (ALB), globulin(GLB), albumin to globulin ratio (A/G) liver function indicators, such as urea nitrogen (BUN), uric acid (UA), creatinine (CR), such as renal function indexes, myocardial function index of creatine phosphokinase (CPK) were analyzed.Under the conditions of 0.5×109cfu/mL and 1×109cfu/mLinfection, the control rates of baits in the 2% baits group were 82.5% and 42.5%, respectively. As compared with the 0% baits group, the efficacy was extremely significant (<0.01). Compared with the control group (healthy fish), the indexes of transaminase, TRIG, TC, TP, ALB, GLB, and A/G of the fish infected with 0.5×109cfu/mLdisease (0% diet group) were decreased (0.05), and the indexes of BUN, UA, CR, and CPK were increased (0.05), while the indexes of the other bait group were improved compared with the 0% bait group and recovered to the level of the control group.The compound could prevent and cure bacterial septicaemia of crucian carp, and improve the function of liver, kidney and myocardium. Compound extract of Chinese herbal medicine (2%) added with baits has significant efficacy in preventing and treating bacterial septicemia of crucian carp.
; bacterial septicaemia; blood biochemical indicators;Compound Chinese herbal medicine; therapeutic effect
S943.117.42+9
A
1673-9159(2020)02-0103-08
10.3969/j.issn.1673-9159.2020.02.015
2019-08-09
河南省科技厅科技攻关项目(122102110146)“新型环境友好型渔药的研制与安全性评价研究”
田海军(1980-)男,硕士,副教授,研究方向为水生动物病理与病害。Email: thj_666@163.com
郑曙明(1958—)女,教授。Email:zhsm22@126.com
田海军,郑曙明. 中药复方对鲫鱼细菌性败血症的防治效果[J]. 广东海洋大学学报,2020,40(2):103-110.
(责任编辑:刘庆颖)