二十二碳五烯酸对淋巴细胞活性及单胺类神经递质的影响

李舒蕊，张 才，张理强，殷静雯，颜海锋，张永平，赵 帅，宋 采,4

二十二碳五烯酸对淋巴细胞活性及单胺类神经递质的影响

李舒蕊1，张 才1，张理强2，殷静雯3，颜海锋3，张永平1，赵 帅1，宋 采1,4

（1. 广东海洋大学食品科技学院，广东 湛江 524088；2. 湛江市第三人民医院，广东 湛江 524012；3. 广东医科大学附属医院，广东 湛江 524023；4. 广东海洋大学深圳研究院，广东 深圳 518120；）

【】研究二十二碳五烯酸（Docosapentaenoic acid，DPA）对精神分裂症患者外周血淋巴细胞的活性及细胞内单胺类神经递质的调节作用。将正常人和病人的外周血淋巴细胞分为对照组、病人组、对照+DPA组（0~200 μmol/L）、病人+DPA组（150 μmol/L），用DPA处理细胞48 h。用CCK8法检测细胞存活率，用高效液相色谱法检测血浆中多巴胺及其代谢物的含量，检测淋巴细胞中去甲肾上腺素、多巴胺、5-羟色胺和代谢物的含量。与对照组相比，精神分裂症患者外周血淋巴细胞存活率下降，血浆中的多巴胺（DA）及其代谢产物二羟苯乙酸（DOPAC）含量上升，淋巴细胞中的多巴胺与其代谢产物、5-羟色胺（5-HT）与其代谢物5-羟吲哚乙酸（5-HIAA）的含量显著下降，DA/DOPAC、5-HT/5-HIAA比值显著升高，去甲肾上腺素代谢物的含量显著下降。DPA可以显著提高淋巴细胞的存活率，提高多巴胺、5-羟色胺及其代谢物的含量，降低DA/DOPAC、5-HT/5-HIAA比值，提高去甲肾上腺素代谢物的含量。DPA可以提高精神分裂症患者外周血淋巴细胞的存活率，调节单胺类神经递质的含量。

二十二碳五烯酸（DPA）；精神分裂症；淋巴细胞；神经递质

精神分裂症是一种发病原因尚未明确的重度精神疾病，在临床表现上会极大的影响患者的感知觉、思维、情感、意志和行为、认知功能[1]。精神分裂症病因十分复杂，目前应用最广泛的是神经递质假说，该假说认为引起精神分裂症的原因是患者体内的神经递质比例失衡，特别是多巴胺和5-羟色胺（5-HT）的异常[2-3]。近年来，免疫炎症假说作为病因学，已经提出免疫炎症对单胺类神经递质的代谢、神经内分泌功能的影响是介导炎症与精神分裂症之间联系的潜在途径[4]。淋巴细胞是免疫炎症中重要的调控细胞[5-8]，外周淋巴细胞可通过脑膜淋巴管与外周免疫系统进入中枢[9-10]，其细胞膜表面能够表达多种神经递质的受体[11]，不仅可介导免疫细胞间的联系，还能参与免疫系统与神经系统之间的双向沟通[12-15]。临床上，典型或非典型的抗精神分裂症药物多是5-羟色胺受体5HTR1A的激动剂，或是5-羟色胺受体5HTR2A和多巴胺受体的拮抗剂[16]，仅能针对部分阳性症状[17-18]，副作用极大，在治疗精神分裂的同时也带给患者巨大的机体伤害。因此，从天然产物中开发一种药效高、副作用小的药物有重要意义。

二十二碳五烯酸（Docosapentaenoic acid，DPA）是人脑组织、神经细胞的主要组成成分，主要存在于海洋哺乳动物的脂质中，在海豹和鲸鱼中的含量较丰富，具有抗炎的作用[19-20]，可以促进和提高人体的免疫能力，修复损伤细胞膜磷脂和单胺类神经递质的膜受体，影响单胺类递质系统的功能并改变它们的储存和释放。二十碳五烯酸（Eicosapentae-noic Acid，EPA）在临床上已被证实可以预防和治疗精神分裂症[21-22]，笔者团队与其他科研人员发现，外源性的EPA在体内代谢生成大量的中间产物DPA，但终产物DHA的含量却没有上升，因此提出设想，EPA在体内是否是通过增加DPA而非DHA的含量起调控作用。在此前的一些研究中，DPA显示了比EPA更好的抗炎与提高免疫的作用，但在改善精神分裂症方面尚未见报道。

本研究采用精神分裂症患者血中淋巴细胞作为模型，通过检测淋巴细胞的存活率、血浆和细胞内单胺类神经递质含量的变化，研究DPA对精神分裂症患者血中淋巴细胞的影响，以期为海洋天然产物DPA的保健产品开发提供相关数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人外周静脉血，广东省湛江市第三人民医院采集；人外周血单核细胞分离液（批号：TBD2011H），天津市灏洋生物制品科技有限责任公司；RPMI 1640培养基（批号：C11875500BT）、胎牛血清（批号：A3160802）、双抗（批号：15140-122），美国gibco公司；DPA（批号：0537605-13），Cayman chemical公司；CCK8（批号：CK04），日本东仁化学科技有限公司；神经递质标准品，美国sigma公司。

1.2 仪器与设备

酶标仪，biotek公司；高效液相色谱，美国安捷伦公司；倒置显微镜，Olympus公司；二氧化碳培养箱，Thermo公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞的处理与培养 病人与对照组在约上午6:00空腹状态下用EDTA抗凝的真空采血管采集静脉血。在4 ℃条件下，1 800 r/min离心10 min，取出血浆，并用相同体积的1640培养基加入到剩余的血细胞中，于50 mL离心管中按比例缓慢加入两倍血细胞体积的分离液（分离液1与分离液2的比例为3∶1），在分离液的上方缓慢加入稀释后的血细胞。以500 r/min离心30 min，取上层白色环状的淋巴细胞于15 mL的离心管中，加入1640培养基清洗细胞，在4℃条件下，以400 r/min转速离心10 min。弃去上清，重复清洗细胞一次。用细胞计数仪记录细胞数目并且收集细胞存活率达到95%以上的淋巴细胞用于下一步培养。

1.3.2 CCK8法检测DPA毒性 将得到的正常人淋巴细胞制成浓度为2×106mL-1的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔100 μL，每组设置5个复孔。按照实验分为对照组（正常人的淋巴细胞）、DPA药物处理组（DPA浓度为10、20、30、40、50、100、150、200 μmol/L）。接种细胞后将96孔板放置在培养箱中平衡3 h，培养箱参数37℃，二氧化碳体积分数5%，待细胞状态稳定，按照分组加入不同浓度的DPA，继续培养48 h后检测DPA对细胞的毒性。检测时每孔加入体积分数为10%的CCK8试剂反应4 h，在波长450 nm下测定各孔的光密度，并计算细胞活性。

1.3.3 DPA浓度的确定 将得到的病人与正常人的淋巴细胞制成细胞浓度为2×106mL-1的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔100 μL，每组设置5个复孔。正常人的淋巴细胞设置为对照组，精神分裂症患者的淋巴细胞设置为药物处理组（DPA浓度为10、20、30、40、50、100、150、200 μmol/L）和未处理组。接种细胞后将96孔板放置在培养箱中平衡3 h，培养箱参数37℃，二氧化碳浓度5%，待细胞状态稳定，按照分组不加入或加入不同浓度的DPA，继续培养48 h后检测细胞活性。每孔加入体积分数为10%的CCK8试剂反应4 h，在450 nm的波长下测定各孔的光密度，并计算细胞活性。取细胞活性最高的浓度作为药物处理浓度。

1.3.4 外周血血浆与淋巴细胞中单胺类神经递质的检测 配置组织裂解液：称取乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）0.018 61 g（称量误差控制在1%以内），加入50 mL超纯水后再缓慢加入5 mL高氯酸，最后用超纯水定容至100 mL。配置高氯酸沉淀剂：称取磷酸氢二钾27.386 4 g和EDTA-Na20.074 4 g（称量误差控制在1%以内）用超纯水溶解并定容至100 mL。收集分离出的血浆200 μL和淋巴细胞2×106个于1.5 mL离心管中，加入组织裂解液100 μL，充分吹打混匀，使细胞破裂释放出神经递质，冰上放置10 min充分裂解。在4℃的条件下，14 000 r/min离心15 min，吸取上清液于1.5 mL的离心管中，按照体积分数比1∶1加入高氯酸沉淀剂，混匀后冰浴10 min。4℃条件下，14 000 r/min离心15 min，用1 mL注射器小心吸取上清。将上清用0.45 μmol/L的水系滤膜过滤至液相专用小瓶中，待用。配置水系流动相：称取柠檬酸10.507 g，无水乙酸钠4.1015 g，庚烷磺酸钠0. 101 125 g和EDTA-Na20.186 12 g，溶解在1 L的超纯水中，再加入三乙胺0.69 mL。水系流动相用0.45 μmol/L的水系滤膜抽滤，甲醇使用0.22 μmol/L的有机膜抽滤，最后两种流动相均在超声清洗仪中脱气5 min除去气泡。色谱柱选用C18柱，流动相由柠檬酸-乙酸钠缓冲溶液、甲醇混合而成（两者体积比为87∶13），流速为1.0 mL/min，进样量为20 μL，FLD检测器，检测波长为：发射波长330 nm和激发波长280 nm。

1.3.5 数据处理 数据处理使用GraphPad Prism 7进行统计分析。细胞部分数据用均值±标准误（±SEM）表示，其余数据用均值±标准差（±SD）表示。数据采用-test分析，< 0.05表示差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 DPA对正常人和精神分裂症患者外周血淋巴细胞存活率的影响

为测定DPA对淋巴细胞的作用，首先评价其对正常淋巴细胞活性的影响。图1可见，所有浓度（10、20、30、40、50、100、150、200 μmol/L）的DPA对正常人外周血淋巴细胞均未产生毒性（＞0.05）。

精神分裂症患者的淋巴细胞活性低于正常人的淋巴细胞（＜0.001），说明病人的淋巴细胞受到了一定程度的损伤。不同浓度的DPA（10、20、30、40、50、100、150、200 μmol/L）均能提高细胞存活率（＜0.05），在DPA浓度达到150 μmol/L时，细胞存活率不再增加，并与未经DPA处理的病人组达到非常显著（＜0.001），因此选用150 μmol/L作为药物处理的浓度，进行后续的实验研究。

2.2 精神分裂症患者外周血血浆中多巴胺及其代谢物含量的变化

图2A、2B中，精神分裂症患者血浆中的多巴胺（DA）及其代谢产物二羟苯乙酸（DOPAC）含量显著升高（＜0.05），而在患者体内过多的多巴胺会引起神经元的持续兴奋，引发病变。图2C、2D中，DA/DOPAC比值升高（＜0.05），说明多巴胺代谢异常，DA/5-HT比值升高（＜0.001），表明精神分裂症患者体内神经递质失衡。

CT，对照组；SZ，病人组；* P<0.05，*** P＜0.001 vs. CT组

2.3 精神分裂症患者外周血淋巴细胞内单胺类神经递质含量的变化

如图3所示，与正常组相比，精神分裂症患者外周血淋巴细胞中的去甲肾上腺素（Norepinephrine，NE）含量无显著变化，代谢物3-甲基-4-羟基苯乙二醇（3-methoxy-4-hydroxy- phenylglycol，MHPG）含量显著下降（＜0.01），NE/MHPG比值显著上升（＜0.05），说明在精神分裂症患者外周血淋巴细胞中，去甲肾上腺素的代谢被抑制。

CT，对照组；SZ，病人组；*P<0.05，**P<0.01 vs. CT组；#P<0.05，##P<0.01 vs. SZ组

如图4A与5A所示，多巴胺（DA）（＜0.01）和5-羟色胺（5-HT）（＜0.001）的含量显著下降，同时图4B与5B也显示它们的代谢产物二羟苯乙酸（DOPAC）（＜0.05）和5-羟吲哚乙酸（5-HIAA）（＜0.0001）的含量显著下降。从图4C、5C与5D中可看出，DA（＜0.05）和5-HT（＜0.01）与他们代谢物的比值均显著上升，DA与5-HT的比值显著升高（<0.0001）。DA与5-HT是兴奋性神经递质，他们的代谢异常、相互之间的比例失衡，被视作精神分裂症发病的重要原因之一，上述结果再次证明了此假说。经DPA处理后，可以显著增加细胞内单胺类神经递质的含量（＜0.01），并且降低NE/MHPG（＜0.05）、DA/DOPAC（＜0.05）、5-HT/5-HIAA（＜0.01）、DA/5-HT（<0.0001）的比值，使得精神分裂症患者外周血淋巴细胞内的单胺类神经递质代谢趋于正常。

CT，对照组；SZ，病人组；*P<0.05，**P<0.01 vs. CT组；#P<0.05，##P<0.01 vs. SZ组

**P<0.01，***P＜0.001，****P<0.0001 vs. CT组；##P<0.01，####P<0.0001 vs. SZ组

3 讨论

本实验显示，病人外周淋巴细胞内的神经递质5-HT和它的代谢产物5-HIAA的含量均显著降低，说明在精神分裂症患者中5-HT能系统功能低下和其代谢发生紊乱，结果与精神分裂症的5-HT假说一致[23]。在血浆与淋巴细胞中多巴胺和它的代谢产物比值显著升高，与多巴胺-动机突显学说一致。同时也发现DA/5-HT的比值显著升高，与DA能系统和5-HT能系统失衡假说一致[24]。结果还显示，精神分裂症病人血浆中NE和它的代谢产物MHPG的比值上升，说明精神分裂症患者中NE能系统功能降低和其代谢发生紊乱，结果与精神分裂症的NE假说一致[25]。在淋巴细胞中加入DPA培养48 h后，再检测淋巴细胞中的神经递质含量，发现上述结果均得到显著逆转。

在淋巴细胞通过免疫炎症系统调控精神分裂症的同时，自身也受到精神分裂症患者体内异常神经递质的影响而改变功能。淋巴细胞释放的促炎因子对多巴胺和去甲肾上腺素的合成和释放有调控作用[11]，而去甲肾上腺素的升高会对T淋巴细胞的增殖产生抑制作用[26]。淋巴细胞产生的促炎因子、免疫相关基因和精神分裂症水平升高以及与疾病相关的脑部改变之间存在联系[10]。DPA提高淋巴细胞的活性可以改善淋巴细胞的异常状态，而调节单胺类神经递质的含量，则在一定程度上具有与抗精神分裂药物相似作用。

4 结论

DPA可以提高精神分裂症外周淋巴细胞的存活率，并对细胞内神经递质含量具有影响，为精神分裂症的海洋药物研发提供了可能性，但其调控作用更深层的分子水平机制仍有待研究。

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Effect of Docosapentaenoic Acid on Lymphocyte Cell Viability and Monoamine Neurotransmitter Content

LI Shu-rui1, ZHANG Cai1, ZHANG Li-qiang2, YIN Jing-wen3, YAN Hai-feng3, ZHANG Yong-ping1, ZHAO Shuai1, SONG Cai1,4

( 1.,,524088,;2.,524012,;3.,524023,4.,518120,)

To study the effect of docosapentaenoic acid (DPA) on the cell viability of peripheral blood lymphocytes and the regulation of monoamine neurotransmitters in patients with schizophrenia.Peripheral blood lymphocytes from normal subjects and patients were divided into control (CT) group, patient (SZ) group, control + DPA group (0-200 μmol/L), patient + DPA group (150 μmol/L), and cells were treated with DPA 48 hour. The cell viability was measured by CCK8 method, and the contents of dopamine and its metabolites in plasma was detected by high performance liquid chromatography, and the content of norepinephrine, dopamine, serotonin and metabolites in lymphocytes were detected.Compared with the control group, the cell viability of peripheral blood lymphocytes in patients with schizophrenia decreased. Plasma dopamine (DA) and its metabolite dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC) increased, the levels of dopamine, serotonin and its metabolites in the lymphocytes decreased significantly. The ratio of DA/DOPAC, 5-HT/5-HIAA increased significantly, and the content of norepinephrine metabolites decreased significantly. DPA can significantly increase the cell viability of lymphocytes, increase the content of dopamine, serotonin and its metabolites, reduce the ratio of DA/DOPAC and 5-HT/5-HIAA, and increase the content of norepinephrine metabolites.DPA can improve the cell viability of peripheral blood lymphocytes and regulate the content of monoamine neurotransmitters in patients with schizophrenia.

docosapentaenoic acid (DPA) ; schizophrenia ; lymphocytes ; neurotransmitters

R749.3；R931.77

A

1673-9159（2020）02-0077-06

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.02.011

2019-11-17

广东省应用型科技研发专项(2016B020235001)；湛江市科技计划项目（2018A01045）

李舒蕊（1993－），女，硕士研究生，研究方向为精神神经免疫学和海洋活性物质研究。E-mail: lishurui1993@163.com

宋采（1956－），女，博士，教授，研究方向为精神神经免疫学和海洋活性物质药理学。E-mail: cai.song@dal.ca

李舒蕊，张才，张理强，等. 二十二碳五烯酸对淋巴细胞活性及单胺类神经递质的影响[J]. 广东海洋大学学报，2020，40（2）：77-82.