超高压结合酶解法提取鱼油工艺优化

张渊超，孙钦秀，魏 帅，刘书成，吉宏武，郝记明，毛伟杰，高 静

超高压结合酶解法提取鱼油工艺优化

张渊超，孙钦秀，魏 帅，刘书成，吉宏武，郝记明，毛伟杰，高 静

（1. 广东海洋大学食品科技学院，广东省水产品加工与安全重点实验室，广东省海洋食品工程技术研发中心，广东省海洋生物制品工程重点实验室，水产品深加工广东普通高校重点实验室，广东 湛江 524088；2. 海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心，大连工业大学，辽宁 大连 116034；3. 南方海洋科学与工程广东省实验室，广东 湛江 524088）

【】优化黄鳍金枪鱼（）副产品（鱼头）提取鱼油的工艺参数。以鱼油提取率为评价指标，采用单因素实验确定最佳超高压处理压强和保压时间，采用Box-Behnken响应面试验设计优化关键酶解工艺参数。建立鱼油提取率与加酶量、液料质量比、酶解温度和酶解时间之间的回归模型，加酶量、液料质量比、酶解温度和酶解时间对鱼油提取率均有显著影响（< 0.05），影响由高到低依次为加酶量、液料质量比、酶解时间、酶解温度；当超高压处理压强200 MPa、处理时间10 min、加酶量（质量分数）为1.125%、液料质量比为1∶1、酶解温度65 ℃和酶解时间60 min时，根据质量法计算，鱼油提取率达99.51%，与模型预测值之间差异无统计学意义（> 0.05）。采用响应面法建立的回归模型较好地描述超高压结合酶解提取鱼油的工艺过程，优化的工艺参数可有效提高鱼油提取率。

鱼油；提取工艺；提取率；超高压；酶解

鱼油因富含二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）等-3多不饱和脂肪酸而具有众多优良的生理活性，在医药和保健品领域受到高度关注。生产鱼油的原料主要是鱼类加工副产物，其脂肪质量分数为1.4％~ 40.1％，脂肪含量的高低主要取决于鱼的种类和部位[1]。在海水鱼类中，脂肪主要沉积在皮肤下以及肌肉、头部和内脏中[2]。金枪鱼是大型海洋洄游鱼类，加工以生鱼片和罐头为主，其加工副产物约占总质量的50% ~ 60%，主要有鱼头、鱼骨和内脏等[3]，是生产高品质鱼油的良好生物资源[4-11]。

传统的鱼油提取方法有压榨法[10]、蒸煮法[11]、溶剂法[12]等。压榨法和蒸煮法的鱼油提取率较低，品质较差；溶剂法易造成溶剂残留。近年来，新型绿色鱼油提取方法渐受关注，主要有酶解法[13]、超临界CO2萃取[14-15]、超声波辅助提取[16]等。本课题组前期利用酶解法从黄鳍金枪鱼鱼头中提取鱼油，提高了鱼油的品质，但鱼油提取率仍偏低[17-18]。超高压（Ultra-high pressure，UHP）是一种在高压条件下使食品物理化学性质迅速发生改变的非热加工技术[19]，可在一定程度上破坏生物组织，促进生物活性物质从细胞内渗出，从而提高有效成分的提取率[20]。本研究在前期酶解提取鱼油的基础上，结合超高压辅助提取活性物质的优点，以黄鳍金枪鱼（）鱼头为原料，以鱼油提取率为指标，考察超高压结合酶解条件对鱼油提取率的影响，优化鱼油提取工艺参数，以实现鱼油的高效提取。

1 材料与方法

1.1 材料

冷冻黄鳍金枪鱼鱼头，质量（1.53±0.37）kg，购于山东省青岛市市场，以-18℃条件运输至实验室。聚乙烯（polyethylene，PE）/聚酰胺（polymide，PA）复合包装袋，购于雄县旭日纸塑包装有限公司。木瓜蛋白酶，购于广西南宁庞博生物工程有限公司，酶活力为105U/g。

1.2 方法

1.2.1 鱼头碎骨肉制备 清水冲洗金枪鱼鱼头表面的杂质，用电锯将金枪鱼鱼头切割成小块，用粉碎机将其均匀绞碎。绞碎后的碎骨肉真空封装于包装袋中，置于-80℃超低温冰箱中冻藏。使用前18 h取出，置于4℃冰箱中解冻至中心温度为4℃。

1.2.2 超高压结合酶解法提取金枪鱼鱼油 称取金枪鱼鱼头碎骨肉50 g，封装于真空包装袋中，置于超高压设备（HPP. L2-600/0.6型，天津华泰森淼生物工程技术有限公司）超高压处理釜中，在100、200、300、400 MPa下分别处理5、10、20、30 min，卸压，取出样品放入烧杯中；以碎骨肉质量为基准，按照一定比例加入蒸馏水和木瓜蛋白酶，在一定温度下恒温搅拌一段时间。酶解结束后，酶解产物在10 000 r/min条件下离心20 min，分离上层油相即为粗鱼油。

1.2.3 试验设计 以鱼油提取率（）为试验指标，以加酶量（1）、液料比（2）、酶解温度（3）和酶解时间（4）为试验因素，采用Box-Behnken试验设计和回归分析探讨酶解条件对鱼油提取率的影响规律。依据蛋白酶最适条件范围，选择合适的因素水平并对其进行编码（表1）。

表1 因素水平编码值

加酶量是以碎骨肉的质量（g）为基准按照质量百分比加入。液料比是指酶解体系中加水质量（g）与碎骨肉质量（g）的比值。鱼油提取率用质量法计算，即提取鱼油的质量（g）与碎骨肉的脂肪质量的比值。碎骨肉的脂肪含量用索氏抽提法[21]测定。鱼油提取率计算公式：

鱼油提取率 = 鱼油质量/(样品质量×粗脂肪质量分数)]。

1.3 数据处理

每个试验重复3次，结果用平均值±标准差表示。采用JMP10.0统计软件进行数据处理。

2 结果与讨论

2.1 超高压处理条件对鱼油提取率的影响

从图1可见，当超高压处理时间为5、10 min时，鱼油提取率随处理压强的增加呈先升后降的变化趋势；当超高压处理时间为20、30 min时，鱼油提取率随着处理压强的增加呈现下降的趋势。

图1 不同超高压压力对鱼油提取率的影响

图2可见，在处理压强相同时，鱼油提取率随着处理时间的延长，呈先升后降的变化趋势。这是因为在超高压处理过程中，细胞内外形成巨大的压力差，使金枪鱼细胞结构破裂，加速细胞内物质流出，在酶解过程中蛋白酶更易于降解蛋白质，从而加速了鱼油的渗透速率，提高了鱼油提取率。但是，当超高压处理压强超过300 MPa或保压时间超过20 min时，持续的较大压力差使鱼肉细胞中的大分子物质渗出，造成溶质堵塞通道，从而减慢了鱼油的渗透速率，造成鱼油提取率降低。这种现象与尹琳琳等[22]、魏炜等[23]发现的规律基本吻合。

图2保压时间对鱼油提取率的影响

从图1可见，鱼油提取率达到峰值的条件组合分别是100 MPa、20 min和200 MPa、10 min，两者的鱼油提取率均接近100%。通过观察两种条件下的鱼油色泽（图3），发现200 MPa、10 min条件下鱼油色泽淡于100 MPa、15 min。依据中华人民共和国水产行业标准SC/T 3502-2016[24]，品质较好的鱼油应呈浅黄色、有微量混浊和沉淀。从图3可见，超高压200 MPa作用10 min后提取的鱼油颜色较浅，沉淀量较少。因此，综合考虑鱼油提取率、色泽和沉淀量，选择超高压处理条件为200 MPa、10 min。

图3 两种不同条件下的鱼油外观

2.2 酶解法提取鱼油回归模型的建立

依据Box-Behnken试验设计和表1的因素水平编码表，建立酶解法提取金枪鱼鱼油的试验方案，测定其鱼油提取率，结果见表2。

表2 Box-Behnken试验设计的方案与结果

对表2数据进行回归分析，并剔除不显著变量后，建立回归模型如下：

= 86.05 + 2.721- 4.852+ 1.203+ 1.594- 1.7012+ 2.3213- 3.6123+ 1.5014- 2.5134+ 4.9812+ 2.9142

对该回归模型的系数进行显著性检验，结果见表3。从表3可知，回归模型的每一项对鱼油提取率的影响均显著（< 0.05）。对该回归模型进行正则变换，如下：

= 86.05 + 5.5812+ 3.522+ 0.7932- 2.0042。

表3 回归模型的系数及其显著性检验

注：*表示< 0.05，影响显著。

Note: * means< 0.05, significant effect.

Box-Behnken试验设计将加酶量、液料比、酶解温度和酶解时间进行了编码，消除了各因素单位的影响，因此，可根据回归模型正则形式的系数绝对值大小判断各因素对鱼油提取率影响的主次关系[24]。各因素对鱼油提取率影响大小顺序为加酶量（1）、液料比（2）、酶解时间（4）、酶解温度（3）。

利用回归模型对表2试验条件下鱼油提取率进行预测，并与鱼油提取率的试验值进行线性相关分析，结果见图4。从图4可以看出，鱼油提取率的预测值与试验值呈较好的线性相关，决定系数2= 0.98，均方根误差RMSE = 0.883 2。这说明回归模型可解释加酶量、液料比、酶解温度和酶解时间引起的98%的鱼油提取率变化，因此，建立的回归模型参考价值较高[25]。对回归模型进行方差分析和失拟性检验，结果见表4。从表4可见，回归模型显著（< 0.05），而失拟性不显著（> 0.05），表明模型在自变量变化范围内[-1，1]的拟合是可行的。

综合回归模型的系数显著性检验、决定系数、方差分析和失拟性检验等结果[24]，充分说明建立的回归模型可用于预测在不同加酶量、液料比、酶解温度和酶解时间处理下的鱼油提取率，可以用来优化工艺参数。

图4 鱼油提取率的试验值与模型预测值之间的相关性

表4 回归模型的方差分析和失拟性检验

注：*表示< 0.05，影响显著。

Note: * means< 0.05, significant effect.

2.3 酶解提取鱼油工艺参数的优化

利用JMP10.0数据处理软件的预测刻画器功能优化酶解提取鱼油的工艺参数，结果见图5。从图5可见，在试验范围内，当1= 0.25、2= -1、3= 1、4= -1时，即加酶量为1.125%、液料比为1∶1、酶解温度为65 ℃、酶解时间为60 min时，鱼油提取率试验值为99.51%，模型预测值为100%，两者之间无显著性差异（> 0.05）。根据表2中数据也可以得出：当加酶量为1.5%、液料比为2∶1、酶解温度45 ℃、酶解时间180 min，鱼油提取率为99.78%；当加酶量为1.5%、液料比为1∶1、酶解温度55℃、酶解时间120 min，鱼油提取率为99.22%；与本实验中预测刻画器得到的最优条件鱼油提取率99.51%之间差异无统计学意义（> 0.05）。但是，加酶量越大，生产成本越高；酶解时间增加，则鱼油在空气中的暴露时间增加，进而鱼油发生氧化而使鱼油品质降低[26]。预测刻画器优化的酶解条件，不仅加酶量低而且酶解时间短，有效减轻因脂肪氧化造成鱼油品质下降问题。综上，选择酶解提取鱼油的最优条件为：加酶量为1.125%，液料比为1∶1，酶解温度65℃，酶解时间60 min。

图5 鱼油提取率的预测优化

鱼油提取最优工艺参数的预测值和实验值相符，再次说明所建回归模型可用于预测超高压预处理后，在不同加酶量、液料比、酶解温度和酶解时间处理下的鱼油提取率。因此，可用模型优化工艺参数，且可分析加酶量、液料比、酶解温度和酶解时间对鱼油提取率的影响规律。

由于回归模型中的变量是编码值，需要将表1中的编码值公式代入回归模型中，如下：

= 69.49 - 59.121+ 18.412+ 0.883- 0.454+ 19.9212+ 0.4613+ 0.0514- 3.4012- 0.3623。

该回归模型即为鱼油提取率（）与实际变量加酶量（1）、液料比（2）、酶解温度（3）和酶解时间（4）之间关系的数学表达式。

3 结论

利用单因素实验确定超高压处理的最适条件，利用Box-Behnken响应面试验设计和回归分析优化酶解提取鱼油的最佳工艺参数，即当超高压处理压强200 MPa、处理时间10 min、加酶量为1.125%、液料比为1∶1、酶解温度65 ℃、酶解时间60 min时，鱼油提取率达99.51%。

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Optimization of Extraction Parameter of Fish Oil by Ultra-high Pressure Combined with Enzymatic Hydrolysis

ZHANG Yuan-chao, SUN Qin-xiu, WEI Shuai, LIU Shu-cheng, JI Hong-wu, HAO Ji-ming, MAO Wei-jie, GAO Jing

（1.,,,,,524088,; 2.,116034,; 3.,524088,）

To optimize the extraction parameters of tuna oil from tuna heads.Using the fish oil extraction efficency as an index, the optimal treatment pressure, holding-time and the Box-Behnken response surface experimental design was used to optimize the key enzymatic parameters.A regression model was established between the fish oil extraction efficiency and the amount of enzyme added, the ratio of liquid to material, the temperature and time used in enzymatic hydrolysis. These factors affected the extraction efficiency of fish oil significantly (< 0.05), and the order of influence was as follows: the amount of enzyme > the ratio of liquid to material> the time of hydrolysis > the temperature of hydrolysis. When the ultra-high pressure treatment pressure was 200 MPa, the processing time was 10 minutes, the added enzyme added was 1.125%, the ratio of liquid to material was 1∶1, the enzymatic hydrolysis temperature was 65 ℃ and the enzymatic hydrolysis time was 60 min. Based on the gravimetric method, the extraction efficiency of fish oil can reach 99.5%. The experimental value was no significant difference from the model prediction value (> 0.05).The regression model established by the response surface method can better describe the extraction process of fish oil by ultra-high pressure combined with enzymatic hydrolysis, and the optimized process parameters can effectively improve the extraction ratio of fish oil.

fish oil; extraction technology; extraction ratio; ultra-high pressure; enzymatic hydrolysis;

TS225.2+4

A

1673-9159（2020）02-0071-06

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.02.010

2019-12-23

南方海洋科学与工程广东省实验室（湛江）（ZJW-2019-06）；国家自然科学基金面上项目（31771997）；广东海洋大学创新强校重大培育项目（GDOU2017052603）；广东普通高等学校水产品加工与利用创新团队项目（GDOU201603503）

张渊超（1995－），男，硕士研究生，研究方向为海洋食品加工新技术。E-mail：2560157927@qq.com

孙钦秀（1986－），女，博士，研究方向为海洋食品加工新技术。E-mail：sunqinxiugo@163.com

刘书成（1977－），男，教授，研究方向为海洋食品加工新技术。E-mail：Lsc771017@163.com

张渊超，孙钦秀，魏帅，等. 超高压结合酶解法提取鱼油工艺优化[J]. 广东海洋大学学报，2020，40（2）：71-76.

（责任编辑：刘庆颖）