转录因子CREB对合浦珠母贝无定型碳酸钙结合蛋白启动子的调节作用

杨 易，高 静，陈 彦，鲁 冰，谢莉萍，张荣庆

转录因子CREB对合浦珠母贝无定型碳酸钙结合蛋白启动子的调节作用

杨 易，高 静，陈 彦，鲁 冰，谢莉萍，张荣庆

（清华大学生命科学学院，北京 100084）

【】研究无定型碳酸钙结合蛋白（ACCBP）基因的上游调控机制。以合浦珠母贝（）为研究对象，利用基因组步移技术克隆合浦珠母贝基因（）的启动子。设计启动子截短实验，通过双荧光素酶标记法确定启动子与转录因子CREB的结合位点，定位启动子中的功能元件。克隆转录因子环腺苷效应元件结合蛋白（CREB），并通过共转染实验和凝胶迁移率分析检测启动子的相对转录活性。获得合浦珠母贝基因的启动子序列，ACCBP启动子在HEK-293T细胞系中转录活性较高；该启动子上存在CRE元件，该元件可在转录过程中与CREB蛋白直接结合，大幅上调ACCBP启动子的转录效率。转录因子CREB可通过与ACCBP启动子上的CRE元件结合而增强转录活性的调控作用。

合浦珠母贝；无定型碳酸钙结合蛋白；环腺苷效应元件结合蛋白；启动子; 转录活性

生物矿化在自然界中广泛存在。在有机大分子的精细调控下，无机物在生物体内特定部位有序沉积，形成骨骼、牙齿、壳体和珍珠等有特殊结构和功能的矿物[1]。软体动物的壳和珍珠因有优良的物理特性和药用价值而广受关注。珍珠培育主要贝类合浦珠母贝是生物矿化领域重要研究对象之一[2-4]。

合浦珠母贝的贝壳和珍珠有相似的结构特点。贝壳分为外侧的棱柱层和内侧的珍珠层两个钙化层[5]。贝壳的形成受以基质蛋白为主的多种有机大分子的调控，基质蛋白起重要调控作用[6-7]。目前已发现数十种基质蛋白在壳体的晶体成核、取向、晶型调节等方面起重要作用。例如，Nacrein蛋白存在于棱柱层和珍珠层中，有碳酸酐酶活性，可通过提供碳酸氢根离子调节碳酸钙晶体的形成[8]；Pearlin蛋白主要存在于珍珠层中，通过与碳酸钙底物结合而特异性地使碳酸钙形成文石晶体；Aspein可诱导棱柱层中方解石晶体的形成[9]。无定形碳酸钙结合蛋白（Amorphous Calcium Carbonate Binding Protein，ACCBP）是从合浦珠母贝外套膜外液中提取的一种基质蛋白[10]，也是维持合浦珠母贝珍珠层文石晶体有序生长和体液系统中碳酸钙过饱和状态的重要功能因子[11]，还是一种碳酸钙结晶的强抑制剂，可通过结合作用抑制碳酸钙晶体的成核，使其以无定形状态稳定存在[12]。ACCBP为间液蛋白，参与无定型碳酸钙（ACC）转化过程中的晶型选择，可通过调控ACC周围的钙镁例子浓度比诱导ACC向文石晶体转化。在细胞囊泡内，ACCBP与镁离子协同诱导ACC的形成[11]。可见，ACCBP可直接影响母贝中的矿化过程。

目前，鲜见关于基质蛋白上游调控机理的研究报道。编码基质蛋白的基因在细胞内受到何种上游调控是值得研究的课题。笔者基于对基质蛋白功能的研究结果，探究在ACCBP转录调控中起关键影响的转录因子，并确定该转录因子的结合位点，有助于理解基质蛋白产生过程的完整信号通路，搭建基质蛋白上游调控的信息网络框架。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验用合浦珠母贝取自广西壮族自治区北海市珍珠养殖场，实验个体均为健康的成体贝，贝壳完整厚度均匀，表面附有大量足丝，使贝之间稳固相连。实验前，贝体放于人工海水缸中，于25℃室温下培养。用于培养的人工海水中含有与海水等渗的钠、钾、钙、镁离子。

1.2 总DNA提取和ACCBP基因启动子克隆

剖取合浦珠母贝闭壳肌组织，加液氮充分研磨。用海洋动物DNA提取试剂盒(DP324，Tiangen) 提取总DNA，并以琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测其浓度和纯度。基于已知的基因序列[12]设计引物，进行上游基因组步移。由多次基因组步移结果获得基因启动子的拼接序列，再用高保真聚合酶KOD (Toyobo) 检测，确定最终的启动子序列。所用引物见表1。

1.3 CREB基因克隆

通过反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）进行。剖取合浦珠母贝外套膜组织，加液氮充分研磨。用试剂盒TRIzol (Trizol Reagent for Total RNA Extraction, Invitrogen) 提取总RNA，并以甲醛变性电泳和分光光度计检测其浓度和完整性。基于基因序列[14]设计引物，克隆得到合浦珠母贝基因的开放阅读框，再用高保真聚合酶KOD (Toyobo) 扩增并测序。所用引物见表1。

1.4 重组质粒的构建

将全长2.3 kb的ACCBP启动子与荧光素酶载体pGL4.10 (Promega) 连接，构成重组表达载体AC-pGL4.10。将所得载体转化入感受态细胞Tran5α进行亚克隆并提纯保存。使用BDGP在线分析软件计算并分析完整启动子序列，预测启动子上CRE元件的位置。根据预测结果，对完整启动子进行不同程度的截短。对完整启动子在预测的CRE位点做不同程度的突变，获得3种启动子突变体，分别为AC-mu-1 (替换了2个碱基)，AC-mu-2 (替换了4个碱基)，AC-mu-3 (替换了8个碱基)，构建突变体所用的全部引物见表1。给获取的每种截短体和突变体分别构建pGL4.10表达载体。

将反转录获得的基因与表达载体pcDNA3.1(+)-myc(Invitrogen) 连接，构成表达载体CREB-pcDNA3.1(+)-myc。将所得载体转化入感受态细胞Tran5α进行亚克隆并提纯保存。

1.5 细胞转染以及转录活性检测

向DMEM缓冲液 (Gibco) 中加入体积分数10%的胎牛血清，制成细胞培养液。在37 ℃、CO2体积分数5%的条件下培养HEK-293T细胞。转染时，用转染试剂VigoFect(Vigorous)，将构建的pGL4.10重组质粒与参照载体pRL-TK (Promega) 进行共转染。转染时用透明48孔板培养细胞，每组细胞使用500 ng pGL4.10重组质粒和5 ng pRL-TK转染。在验证启动子与转录因子相互作用的实验中，还在上述基础上同时转染500 ng CREB-pcDNA3.1(+)的重组质粒或pcDNA3.1(+)空质粒。

表1 实验中所使用的引物

将转染后细胞继续培养36 h后进行荧光素酶检测。用细胞裂解液Passive lysis buffer (Promega)在室温下将细胞充分裂解。用多功能读数仪VarioskanTMFlash (Thermo Scientific) 检测启动子相对转录活性。

1.6 电泳迁移率分析(EMSA)

分别将转染的CREB-pcDNA3.1(+)-myc重组质粒和pcDNA3.1(+)-myc空质粒的HEK-293T细胞培养24 h。用细胞核抽提试剂NE-PER (Thermo Scientific) 抽提两组细胞的细胞核蛋白，提取物保存在-80℃下待用。EMSA分析前，用蛋白质检测试剂PierceTMBCA (Thermo Scientific) 检测提取的核蛋白浓度。EMSA分析所用引物由5′ 端生物素标记的互补单链DNA退火合成。同时设计未加生物素标记的探针作为对照。探针具体信息见表2。用化学发光EMSA分析试剂盒LightShiftTM(Thermo Scientific) 进行EMSA分析。每个电泳泳道核蛋白提取物用量5 μg，已标记探针用量5 ng，在不同实验组中分别加入50倍竞争探针、100倍竞争探针和抗体，泳道安排详见2.4部分图4注释。实验结果使用化学发光成像系统(Thermo Scientific) 检测。

表2 EMSA分析用探针

2 结果与分析

2.1 基质蛋白ACCBP的基因启动子和转录因子CREB基因

克隆的基因启动子片段全长2 374 bp，由两次基因组步移获取的片段拼接而成，序列如图1所示。根据BDGP在线软件分析和RACE检测结果，比较分析获得的启动子转录起始位点（图1）。根据转录起始位点可将片段全长记为（-2 269，+105）。

所克隆转录因子CREB的基因片段开放阅读框序列长度为1 728 bp，编码576个氨基酸。

方框加粗字符为转录起始位点The transcriptional initiation site marked by framed bold letter

图1 ACCBP基因的启动子全序列

Fig. 1 Sequence of the promoter of gene ACCBP

2.2 ACCBP启动子及其截短体的转录活性

将构建的ACCBP启动子亚克隆载体AC-pGL4.10转染到HEK-293T细胞系中培养，用双荧光素酶报告方法以及所构建的启动子截短体载体检测其转录活性，获得不同长度启动子截短体的转录活性。双荧光素酶报告结果如图2所示。图2可见，重组载体AC-pGL4.10的转录活性是空载体pGL4.10的28倍，即表示启动子在HEK-293T细胞系中转录活性较高。对比tru-1和tru-2可发现，差异区域（-2 192，-2 082）的缺失使启动子的转录活性大幅降低。同时，由软件预测的CRE元件位置为（-2 126，-2 118）。该预测结果在定位上与截短体检测结果相符合，表明该区域含有影响启动子转录活性的重要元件CRE。同时tru-7转录活性明显降低，是RNA聚合酶结合位点不完整所致。

2.3 转录因子CREB对ACCBP启动子转录活性的影响

将CREB-pcDNA3.1(+)-myc与ACCBP启动子载体（AC-pGL4.10）共转染入HEK-293T细胞系中培养，同时将3种突变体的pGL载体与CREB-pcDNA3.1(+)-myc共转作为参照。双荧光素酶报告结果见图3。图3可见，转录因子CREB可大幅上调ACCBP启动子的转录活性，却对空载体的转录活性无影响。对3种突变的启动子而言，在CRE位点的突变程度越大，该突变体受到CREB的上调作用越小。可见，转录因子CREB通过与CRE位点的特定序列相互作用，增强ACCBP启动子的转录活性。特定序列的丢失导致启动子对CREB的应答效果减弱甚至消失。

A，启动子和截短体构成的表达载体示意图，包含完整启动子、7种截短体以及空载体的表达载体；B，每种表达载体对应的双荧光素酶报告系统检测结果。图中相对荧光素酶活性即表示对应表达载体的转录活性；截短体tru-1与tru-2的转录活性差异明显，为15个单位。

图3 转录因子CREB对ACCBP启动子及其截短体转录活性的影响

2.4 转录因子CREB与CRE位点的结合

电泳迁移率分析的电泳结果如图4所示。图4中泳道1和6为空白对照。泳道3表明，CREB蛋白与带生物素标记的CRE探针可形成DNA-蛋白质复合物。泳道2和5表明，在50倍和100倍浓度未标记探针的竞争作用下，被标记探针的迁移带因受竞争而分离，且100倍浓度的竞争效果强于50倍。泳道4中，在myc抗体的影响下，探针、蛋白、抗体相互结合而形成超迁移带。泳道7和8为阴性对照，探针与未转染CREB的核蛋白提取物未见显著结合。可见，转录因子CREB通过与启动子DNA上CRE元件的直接结合调节ACCBP启动子的转录活性。

图4 EMSA实验结果

3 讨论

目前，对基质蛋白在合浦珠母贝矿化过程中的核心作用已有广泛研究，但这些蛋白编码基因的上游调控机制仍待阐明。因此，解析基质蛋白ACCBP在合浦珠母贝中的上游调控机理有重要意义。

软体动物贝壳与脊椎动物骨骼一样，为生物矿化的产物。在哺乳动物中，骨骼发育等调控机理已有较为成熟的研究成果。研究发现，与在某些哺乳动物中起重要调控作用的转录因子（Pf-AP-1、Pf-Rel等）同源的转录因子在合浦珠母贝中亦可调控基质蛋白的表达[13]。本研究涉及的转录因子CREB在人神经系统发育中的促进作用广受关注[14]。

转录因子CREB由两个结构域组成，一是含碱性亮氨酸拉链结构的激酶诱导区域，包括多个磷酸化位点，可被PKA、PKC等多种蛋白激酶磷酸化；二是富含谷氨酰胺残基的区域，与RNA聚合酶的结合有关。CREB通过与其下游启动子区的CRE元件（环腺苷效应元件）结合发挥作用。CRE元件含有高度保守的8碱基回文序列，即5′-TGACGT CA-3′。在应激状态下，CREB作为一种细胞核内调控因子与CRE元件结合，通过自身磷酸化实现调节转录的功能。而在稳态条件下，CREB的异构体以无活性非磷酸化的形式存在。本研究中，由于现有研究对CRE元件的了解较为清晰明确，在启动子上易定位到该元件。对CRE元件位点的突变试验显示，该位点的突变既使启动子的转录活性大幅下降，又减弱了转录因子CREB对启动子的激活作用，且这两种影响与突变程度呈正相关性，表明CRE元件在转录调控中有重要作用。

为进一步说明CREB可通过与启动子上的CRE位点直接结合而起调控转录活性作用，笔者设计EMSA实验来验证两者体外结合能力的强度。结果表明，合浦珠母贝CREB基因在HEK-293T细胞系中表达的核蛋白可与ACCBP启动子中的CRE元件特异性结合，且该结合作用可被特异性竞争取代。未转染CREB的核蛋白提取物与探针无显著结合的结果，以及在myc抗体的作用下形成超迁移带的现象，均为CREB与ACCBP启动子上CRE位点的特异性结合提供了证据。

4 结语

本研究证明，ACCBP启动子的转录活性受转录因子CREB的正向调控。然而，细胞内的基因调控并不是单一、单向的。上述调控是否存在反馈机制，以及调控过程中是否存在多种转录因子的剂量效应，有待于进一步研究。未来研究应进一步加强对基质蛋白基因调控因子的挖掘，同时进一步了解调控的机理和反馈机制，以期最终构建出调控启动子转录活性的分子调控网络。

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Regulation of ACCBP Promoter by Transcription Factor CREB in

YANG Yi, GAO Jing, CHEN Yan, LU Bing, XIE Li-ping, ZHANG Rong-qing

（,,100084,）

【】To study the promoter region in the regulatory mechanism of.【】The promoter ofwere cloned by genome-walking PCR. Promoter deletion analysis clones were produced for the dual-luciferase reporter assay to find the binding site of transcription factor CREB, and locate the functional element of the promoter. A classic transcription factor, cAMP-response element binding protein (CREB), was cloned for transient co-transfection assays and electrophoretic mobility shift assay for detecting the relative transcription activity of the promoter. 【】The promoter ofwas sequenced, and the promoter showed high transcription activity in cell line HEK-239T. The promoter was confirmed to have a CRE element that interacted with CREB and resulted in enhancing the transcription efficiency 【】CREB can enhance the transcription ability ofby binding the CRE site on the promoter.

; Amorphous Calcium Carbonate Binding Protein; cAMP-response element binding protein; promoter; transcription ability

Q493.2

A

1673-9159（2020）02-0007-06

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.02.002

2017-05-09

清华大学研究生院基金“生物矿化细胞对珍珠层形成的作用及其调控机制”（31372502）

杨易（1992－），男，硕士，专业方向为海洋生物学。

张荣庆，男，教授。E-mail：rqzhang@mail.tsinghua.edu.cn

杨易，高静，陈彦，等. 转录因子CREB对合浦珠母贝无定型碳酸钙结合蛋白启动子的调节作用[J]. 广东海洋大学学报，2020，40（2）：7-12.

（责任编辑：刘庆颖）