植物在高温胁迫下的蛋白质组学研究进展

许英旭，沙伟，张梅娟，马天意

（齐齐哈尔大学 1.生命科学与农林学院，2.抗性基因工程与寒地生物多样性保护黑龙江重点实验室，黑龙江 齐齐哈尔 161006）

植物在生长发育过程中会受到许多不利于生长的生物胁迫因子和非生物胁迫因子的影响，如高温、干旱、冻害、盐碱、冷害、水涝、环境污染、病菌、病虫侵害等，而温度是一种非常重要的非生物胁迫因素，对植物的生长发育具有重要的影响[1].在热胁迫条件下，所有生物体都会产生热休克反应，并对温度上升作出反应.每种植物的生长发育都有特定的温度需求，一般植物生长温度大约在0～44 ℃，其温度的敏感度与其起源地有紧密的联系[2].在持续恶化的情况下，深入了解植物抗逆反应机制，为今后的植物生长发育提供重要的理论基础和指导意义.

高温胁迫对植物的损害主要是通过使细胞中的蛋白质变性和失活，减缓或停止生化反应，停止生长和发育，甚至死亡[3].高温胁迫会增强植物的蒸腾作用，使水分流失过多，为了减小蒸腾，植物叶片气孔关闭，导致CO2摄入量减少，由于CO2是植物光合作用所必需的，高温胁迫会因此影响光合作用，即有机物的积累[4].植物体内的各种生理生化反应都是由酶催化的，高温胁迫会影响酶的活性，从而影响植物生长代谢[5].

本文对高温胁迫下幼苗期植物和成苗期植物的蛋白质组学进行综述，深入了解高温胁迫下植物的基因表达调控机制，植物对高温胁迫的响应机制，对提高作物抗性，培育耐高温新品种具有重要意义，也为今后植物在高温胁迫下的蛋白质组学研究提供理论基础和重要依据.

1 高温胁迫下幼苗期植物的蛋白质组学分析

Han[6]等在35，40，45 ℃条件下分别对7 日龄水稻（Oryza sativa）幼苗处理48 h，并检测其叶片的蛋白质组，发现在35～45 ℃时，连接木质化相关蛋白和1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶表达下调，而保护蛋白表达显著上调.不同的高温会诱导植物采取不同的适应策略，保护机制主要是使植物维持光合作用能力.当温度上升到40 ℃或更高时，一些抗氧化途径被激活；当遇到45 ℃的高温时，各种热休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）均被诱导表达，与热休克蛋白相关的保护机制被激活.可以看出，随着环境温度的升高，植物会调用越来越多的保护机制参与和维持机体正常的生理代谢.

Mohammadi[7]等将发芽2 日龄油菜（Brassica campestris）幼苗分别置于较高的温度（白天45 ℃，晚上34 ℃）胁迫和对照条件（白天22 ℃，晚上18 ℃）下，在生长室中进行16 h/8 h（光照/黑暗）的光周期，相对湿度为65%～70%，持续12 h.通过双向电泳（Two-dimensional electrophoresis，2-DE）进行分离，鉴定出381 个蛋白质点，其中58 个蛋白质在高温胁迫下发生了显著变化，27 个和31 个蛋白质分别显著下调和上调，超过30%的已鉴定蛋白质属于叶绿体，大多数剩余的蛋白质被预测定位在细胞质中.通过统计分析表明，高温胁迫对蛋白质表达水平有重要影响，参与细胞运输、能量和代谢的蛋白质的上调，以及参与疾病、防御、蛋白质合成和信号转导的一些蛋白质的下调可能是高温胁迫下生理和形态反应的主要原因.在油菜下胚轴中观察到的抗坏血酸过氧化物酶蛋白和基因表达水平对高温胁迫反应的增加表明，抗坏血酸过氧化物酶是一种短期高温胁迫反应蛋白，该研究结果还表明，热胁迫下参与能量和代谢的蛋白质的上调可以利用油菜幼苗的大部分营养储备，这可能是热胁迫条件下油菜生长减缓的原因.

2 高温胁迫下成苗期植物的蛋白质组学分析

2.1 高温胁迫下粮食作物的蛋白质组学分析

Smruti Das[8]等使水稻（cv.N22）在开花期经受28 ℃/18 ℃（对照）和42 ℃/32 ℃（高温胁迫）处理后检测叶片蛋白质组.在对照和受胁迫的叶片中，大约存在111 个共同的蛋白质点，其中37 个上调，15个下调，另外还有59 个未鉴定出的蛋白质点，成对蛋白质点的体积呈线性分布.从受高温胁迫的叶蛋白质组中，通过MALDI-TOF MS 分析鉴定，186 个蛋白质独特点中有30 个具有参与光合作用、解毒、能量代谢和蛋白质生物合成的主要功能.在生长室条件下，当水稻在42 ℃的温度下处理24 h 时，发现一组低分子量小热休克蛋白（sHSPs）是由水稻叶片中的高温胁迫诱导的，水稻叶绿体sHSP 在大肠杆菌（Escherichiacoli）中表达赋予了大肠杆菌对热胁迫和氧化应激更好的耐受性，即sHSP 在植物获得的压力耐受性中发挥重要作用；氧化还原稳态在胁迫条件下，易于产生活性氧（reactive oxygen species，ROS），其作为应激反应的信号分子会对细胞成分造成伤害.同时，受胁迫的叶蛋白质组揭示了几种新合成的糖酵解蛋白[9].

据报道，在一定范围内气温每升高1 ℃，小麦（Triticum aestivum）产量就会减少4%[10].高温导致膜渗透性和稳定性改变[11-12]，以及由热诱导的细胞膜渗漏导致的电解质流失均被认为是严重细胞损伤的一种测量方法[13-14].高温胁迫加速了分子在膜上的动能和运动，从而使生物膜分子内的化学键松动，这使得生物膜的脂双层通过蛋白质变性或不饱和脂肪酸的增加而变得更具流动性[15].Kumar[16]等对乳熟期小麦品种HD2985 分别进行22 ℃（对照）和42 ℃（热激）处理2 h，并对叶片样品进行热响应蛋白鉴定.使用Orbitrap质谱，分别鉴定了47 和38 个独特的蛋白质点，其中19 个在对照和热胁迫处理的样品中有差异表达，差异表达蛋白质包括热休克蛋白70、氧释放增强蛋白、钙调蛋白、应激预测蛋白、茜草素、茜草素活化酶等.使用第二代蛋白质组学工具-轨道芯片鉴定差异表达的多肽，可以在对照和热激处理的样品中观察到97 和262 个多肽.分析显示，对照组、高温胁迫处理组和2 个样品中分别有25，190，72 个多肽，使用轨道阱（无标记）分析，在拟南芥（Arabidopsisthaliana）蛋白质数据库进行检索，在对照组中检索到97 个多肽和60 个蛋白质；在热激处理组中鉴定到262 个多肽和135 个蛋白质；类似地，使用水稻蛋白质数据库鉴定了317 个多肽、164 个蛋白质（对照）和592 个多肽、263 个蛋白质接入组，所鉴定到的蛋白质大多数被认为是应激相关蛋白，如热休克蛋白70、三磷酸腺苷合酶、茜草小亚基等，这些蛋白质参与各种生物途径，如碳水化合物代谢、信号传导途径、脂质代谢等.

2.2 高温胁迫下蔬菜作物的蛋白质组学分析

Huang W[17]等使用蛋白质组学方法分析了不同温度处理（4，25，38 ℃）下芹菜叶的蛋白质，共鉴定出71 种蛋白质，被分为14 个功能类，包括光合作用、碳水化合物代谢、氨基酸代谢、蛋白质代谢、信号转导和能量代谢等.在高温胁迫下，芹菜（Apiumgraveolens）叶中近一半蛋白质下调表达.鉴定的蛋白质还参与许多代谢途径，如光合作用、氨基酸代谢、蛋白质代谢、碳水化合物代谢和能量代谢，这些代谢途径对非温度响应网络有重要影响；这些蛋白质可能相互作用，在冷或热胁迫下在芹菜叶片中建立温度胁迫响应网络.

Wang Y[18]等对2 种龙须菜（Gracilarialemaneiformis）株系981 和07-2 在3 个温度（25，30，35℃）下培养48 h，对2 种株系在热处理下的生理参数进行分析.结果表明，随着温度的升高，2 种株系的比生长速率和光化学效率均降低.实验发现，株系981 中的藻胆蛋白和可溶性蛋白质浓度在35 ℃下降低；株系07-2 中的藻胆蛋白和可溶性蛋白质浓度表现出初始降低，然后在高温处理（25，30，35 ℃）下恢复.使用双向电泳进行2 种株系在35 ℃下的蛋白质组学分析，鉴定了13 种蛋白质，并将这些蛋白质根据功能分为8 类，包括光合作用、能量代谢、蛋白质折叠催化、转录、分子伴侣和未知功能.热休克蛋白和亲环蛋白样蛋白通过双向电泳鉴定为在35 ℃热应激下2 种株系中的热响应蛋白，并发现胞质型HSP70 蛋白在蛋白质折叠中作为分子伴侣发挥关键作用，并有助于改善由热胁迫引起的损伤，从而保持细胞稳态；HSP82蛋白可能在热应激下对龙须菜的保护起到支持作用，该研究认为这种胞质型热休克蛋白在改善热胁迫引起的损伤方面起到重要作用.

高温胁迫直接导致蛋白质变性、聚集和膜脂流动性增加，但也间接导致叶绿体和线粒体中酶的失活，蛋白质合成和降解的抑制以及膜完整性的损害[19-20].因此，更好地理解植物的耐热机制对培育耐热作物至关重要.为了抵消高温胁迫的有害影响，植物通过改变基因表达、蛋白质合成和翻译后修饰采用了多种胁迫耐受策略，这有助于在高温下重建植物生存的细胞稳态[19]3.文献[21]对菠菜（Spinacia oleracea）同源自交系Sp75 进行了高温（37 ℃/32 ℃，光照/黑暗）处理，然后收集完全展开的真叶，对其进行蛋白质组学分析，发现高温胁迫处理菠菜叶片，脯氨酸、可溶性糖、丙二醛和电解液相对泄漏含量均增加，表明高温胁迫下菠菜叶片的膜完整性丧失.使用基于iTRAQ 的定量蛋白质组学方法分析了菠菜叶中的热应激反应蛋白丰度模式，共鉴定出叶中的2 205 种蛋白质，其中911 个被定义为高温胁迫响应蛋白，这些蛋白质在清除活性氧、脂质信号、钙信号传递、磷酸化级联和14-3-3 介导的信号通路等途径中发挥重要作用.每组中的大多数高温胁迫反应蛋白都增加了热应激，包括转录、蛋白质合成、蛋白质加工和蛋白质降解，这表明基因表达和蛋白质周转在对高温胁迫的反应中得到增强.虽然光合作用受到抑制，但不同的初级和次级代谢途径被用于防御热应激，如糖酵解、戊糖磷酸途径、氨基酸代谢、脂肪酸代谢、核苷酸代谢、维生素代谢和类异戊二烯生物合成，这些数据构成了菠菜对热应激反应的代谢图谱，有助于进一步研究植物热适应的复杂分子机制，并为菠菜分子育种计划提供信息.

2.3 高温胁迫模式下植物的蛋白质组学分析

Rocco[22]等将拟南芥莲座叶分别在黑暗中于冷胁迫（4 ℃）和高温胁迫（42 ℃）处理后，进行蛋白质组学分析，2 种温度处理下都改变了拟南芥莲座叶细胞膜离子渗透性.共检测到38 个蛋白质点，丰度随冷或热胁迫而变化，2 种温度处理都影响25 个蛋白质的表达水平.分析表明，拟南芥短期低温处理对植物光合作用的特定过程有显著影响，导致了参与电子运输/能量产生和碳代谢反应的蛋白质的数量增加，或者至少是它们的特定同种型的数量增加.拟南芥幼苗的短期高温胁迫处理也影响参与光合电子传递和碳代谢的叶蛋白丰度，表明高温胁迫对糖酵解产生负面影响.

3 植物响应高温胁迫下蛋白质组学存在的问题

近年来，植物蛋白质组学的研究方法并没有受到很大的束缚，它为解释植物繁殖发育过程中关键事件对外界环境因素响应的分子机制提供了新的蛋白质组学证据.但是，与酵母和动物蛋白质组学的快速发现相比，植物蛋白质组学的进展相对缓慢，主要表现在4 个方面：

（1）受基因组背景和跨物种蛋白质鉴定技术的限制，研究对象仍主要集中在苜蓿（Medicago Sativa）、菠菜[21]1-22、拟南芥[22]1257-1267、小麦[15-16，23]、大麦（Hordeum vulgare）[24]、水稻[6，8，25]、大豆（Glycine max）[26]等几个有限的品种；

（2）更多的研究集中于环境胁迫下差异表达的蛋白质，而对蛋白质翻译后修饰和蛋白质-蛋白质相互作用研究较少；

（3）在基于2-DE 凝胶分析差异表达蛋白的表达丰度时，缺乏严谨多样的统计分析，甚至基于2DE-MS技术的整体策略也缺乏标准的实验设计、数据处理以及分析方案，使得比较不同研究小组报告的结果变得困难.

此外，我国植物蛋白质组学研究队伍分散，技术平台薄弱.与快速发展的人类蛋白质组学相比，我国的植物蛋白质组学研究相对落后.植物蛋白质组学未来的发展方向仍是精确定量蛋白质组学技术的广泛应用和蛋白质翻译后修饰的深入研究.

4 植物在高温胁迫下蛋白质组学未来的发展方向

植物对高温胁迫下蛋白质组学的响应是一个非常复杂的系统，涉及信号转导、基因调控、蛋白质修饰和代谢调控等一系列细胞途径.在未来的研究发展中，重点应放在3 个方面：

（1）建立蛋白质调控网络，全面观察植物对高温胁迫的响应，深入研究信号调控.

（2）重点研究蛋白质翻译后修饰.有证据表明，不同的翻译后修饰对高温胁迫响应具有重要影响.

（3）从研究蛋白质相互作用的总体策略出发，充分利用酵母单杂交、酵母双杂交和其它新技术手段，为细胞的信号传递和蛋白质相互作用提供更直接的证据.

综上所述，植物高温胁迫下蛋白质组学正处于发展阶段，随着科技创新和技术进步，会有更多与植物响应高温胁迫相关的蛋白或基因被挖掘，对提高作物抗性，培育耐高温新品种具有重要意义，为植物抗逆研究提供了理论基础和依据.