脾肾两助丸质量标准研究

2020-03-15张卫莲曹蓉蓉刘继青

中国药业 2020年5期

张卫莲，曹蓉蓉，刘继青，陈浩

（陕西省榆林市药品检验所，陕西榆林 719000）

脾肾两助丸由党参、山药、黄芪、白芍、熟地黄、山茱萸等30 味中药材组方，为黑褐色的大蜜丸，味甜、微酸，临床用于治疗脾肾虚弱而致的肢体倦怠、气虚无力、腰痛腰困、头昏耳鸣等症状。本品收载于《卫生部药品标准·中药成方制剂（第八册）》（WS3-B-1654-93，Z8-192），标准中仅有性状、显微及检查项，缺少薄层鉴别和含量测定，不利于产品的系统研究和内在质量控制。本研究中通过对脾肾两助丸的研究，并结合相关参考文献[1-13]，制订了该复方制剂中黄芪、白芍指标性成分的薄层色谱（TLC）定性鉴别方法及山茱萸中有效成分莫诺苷、马钱苷的高效液相色谱（HPLC）定量检测方法，旨在更好地控制脾肾两助丸的质量。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260 型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司），包括Agilent open LAB CDS chemstation 色谱工作站，VWD 紫外检测器；MS205DU 型电子天平（梅特勒-托利多仪器公司，精度为十万分之一）；AS5150A 型超声波清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司，功率为180 W）。

1.2 试药

莫诺苷对照品（批号为111998-201703），马钱苷对照品（批号为111640-201604），黄芪甲苷对照品（批号为110781-200613），芍药苷对照品（批号为110736-201640），白芍对照药材（批号为0905-200508），均购自中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯；水为超纯水；硅胶G 板（青岛海浪硅胶干燥剂有限公司）；脾肾两助丸（批号分别为20170401，20170801，20171101，规格为每丸9 g）及阴性样品均由山西华康药业股份有限公司提供；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 TLC 定性鉴别

黄芪：取脾肾两助丸18 g，剪碎，加硅燥土6 g，研匀，加甲醇50 mL，超声（180 W，40 kHz）30 min，过滤，滤液浓缩至20 mL，加在中性氧化铝柱（100 ～200 目，4 g，内径1.0 ～1.5 cm）上，用40%甲醇80 mL 洗脱，将洗脱液蒸干，加水30 mL 溶解残渣，用水饱和过的正丁醇萃取3 次，每次15 mL，合并正丁醇液，再用氨试液洗涤2次，每次25 mL，弃去氨试液，取正丁醇液，蒸干，用甲醇2 mL 溶解残渣，作为供试品溶液。另取黄芪甲苷对照品5 mg，精密称定，加5 mL 甲醇溶解，制成对照品溶液。按处方比例和工艺，制成缺黄芩的阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。照2015 年版《中国药典（四部）》TLC 法（通则0502）试验，吸取以上3 种溶液各10 μL，点于同一硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷-水-甲醇（13 ∶2 ∶7）的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，日光与紫外光灯（365 nm）下检视。供试品溶液色谱中，均有黄芪甲苷的特征斑点，且阴性对照无干扰（见图1 A）。

图1 薄层色谱图

白芍：取黄芪定性鉴别项下的供试品溶液。另取白芍对照药材1 g，加乙醇20 mL，振摇5 min，过滤，滤液蒸干，用乙醇1 mL 溶解残渣，制成对照药材溶液。再取芍药苷对照品5 mg，加乙醇5 mL，溶解，制成对照品溶液。按处方比例和工艺，制成缺白芍的阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。照2015 年版《中国药典（四部）》TLC 法（通则0502）试验，吸取以上4 种溶液各10 μL，点于同一硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯-甲酸（40 ∶10 ∶5 ∶0.2，V/ V/ V/ V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%香草醛硫酸溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，日光下检视，供试品溶液色谱中，均有芍药苷及白芍药材的特征斑点，且阴性对照无干扰（见图1 B）。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Aglient-5-TC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：A 为乙腈，B 为3 mL/L 磷酸，梯度洗脱（0 ～5 min 时5%A，5 ～20 min 时8%A，20 ～35 min 时20%A，35 ～45 min 时60%A，45 ～55 min 时60%A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：240 nm；进样量：10 μL；柱温：40 ℃。

2.2.2 溶液制备

取供试品，剪碎，取2.0 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理（180 W，40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，过滤，取续滤液，即得供试品溶液。取莫诺苷对照品（标示量为97.4%）10.42 mg 和经P2O5减压干燥12 h 的马钱苷对照品9.36 mg，精密称定，分别置10 mL 容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，制成对照品溶液。按照脾肾两助丸的处方比例和工艺取缺山茱萸的药材制成阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

专属性试验：分别取上述3 种溶液，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图。结果在莫诺苷对照品、马钱苷对照品色谱峰位置上，阴性样品不出峰，表明阴性对照对测定无干扰。色谱图见图2。

线性关系考察：取2.2.2 项下对照品溶液作为对照品母液，逐级稀释成每1 mL 含莫诺苷40.60，20.30，10.15，5.07，2.54，1.27 μg，含马钱苷37.44，18.72，9.36，4.68，2.34，1.17 μg 的对照品梯度溶液。分别精密吸取上述溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录峰面积。以质量浓度（X，μg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，莫诺苷和马钱苷线性回归方程分别为Y莫=18.43869X-0.84240（r=0.9999）和Y马=18.00140X-0.466 17（r=0.999 9）。结果表明，莫诺苷和马钱苷质量浓度在1.269 ～40.596 μg/mL（n=6）和1.170 ～37.440 μg/mL（n=6）范围内与峰面积线性关系良好。

图2 高效液相色谱图

表1 加样回收试验结果（ n=6）

精密度试验：取同一对照品溶液，精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，重复进样6 次，记录峰面积。结果莫诺苷和马钱苷的RSD分别为0.20%和0.05%，表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批（批号为20170801）样品6份，按供试品溶液制备方法制备，在拟订色谱条件下进行测定，采用外标法计算含量。结果莫诺苷和马钱苷的平均含量分别为0.300 5，0.293 2 mg/mL，RSD均为0.36%，表明方法重复性良好。

稳定性考察：取同一供试品溶液（批号为20170801），在拟订色谱条件下，分别于0，2，4，8，12，24 h 时进样测定。结果莫诺苷和马钱苷的RSD分别为0.18% 和0.68%，表明两者在24 h 内稳定性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品（批号20170801）1.0g，剪碎，精密称定，加入莫诺苷对照品溶液1 014.9 μg/mL 0.3 mL 和马钱苷对照品溶液936.0 μg/mL 0.31 mL，按供试品溶液制备方法制备，平行制备6 份，按拟订色谱条件下测定，计算回收率。结果见表1。

2.2.4 样品测定结果

取3 批脾肾两助丸，按2.2.2 项下方法制备供试品溶液，按拟订色谱条件测定，采用外标法分别计算含量。结果莫诺苷的含量分别为0.354 4，0.300 5，0.352 4 mg/g（n=6）；马钱苷的含量分别为0.287 0，0.293 2，0.284 0 mg/g（n=6）。

3 讨论

3.1 提取溶剂选择

取供试品，剪碎，取2.0 g，精密称定，置锥形瓶中，分别精密加入4 种不同体积分数的甲醇溶解（50%甲醇，70%甲醇，80%甲醇，甲醇）各25 mL，超声（180 W，40 kHz）30 min，滤过，取续滤液，依法进行试验。结果表明，用50%甲醇提取，莫诺苷和马钱苷测定的峰面积最大，提取最完全，且分离度符合要求。

3.2 提取方法选择

取供试品，剪碎，取2.0 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入优选的溶剂50%甲醇25 mL，分别用7 种不同方法提取：超声30 min；超声45 min；超声60 min；超声15 min+回流1 h；回流1 h；超声30 min+回流30 min，滤过，取续滤液；回流1 h，滤过，取续滤液10 mL，加在中性氧化铝柱（100 ～200 目，4 g，内径1.0 ～1.5 cm）上，用40%甲醇80 mL 洗脱，将流出液及洗脱液蒸干，用50%甲醇2 mL 溶解残渣，置10 mL 容量瓶中，加50%甲醇至刻度。试验结果表明，7 种提取工艺方法所测得含量无明显差异，故提取方法采用超声（180 W，40 kHz）30 min，方法简便，时间短，且提取完全。

黄芪、白芍的TCL 鉴别项中，通过改进2015 年版《中国药典（一部）》[1]中的提取方法，可得到斑点清晰、专属性好的色谱图，且阴性对照验证了鉴别方法的可行性。