基于指纹图谱分析和多成分同时定量的玉屏风丸质量评价

王巧清

（中国人民解放军联勤保障部队第900 医院，福建 福州 350000）

玉屏风丸由黄芪、炒白术及防风3 味中药材加工而成，具有益气、固表、止汗功效，主要用于表虚不固、自汗恶风，面色白，或体虚易感风邪者，现收载于《卫生部药品标准·中药成方制剂（第一册）》[1]。目前，相关研究多集中于玉屏风颗粒剂及散剂等的质量控制[2-3]。作为中医药经典剂型，丸剂具有代表性和传承性，玉屏风丸在胃肠道中溶散缓慢，药效持久，发挥药效“缓而不迟”，且方便服用、携带和贮存。复方药效物质基础及质量控制研究在于多味药材的多成分含量测定，而中药指纹图谱正是利用其“整体性”及“模糊性”的特点，全面反映中药化学的相关性，整体评价其质量。中药指纹图谱具有同时、高效、定性定量分析的特点，已广泛运用到中药复方多类多成分研究领域[4-6]。为了更全面、有效地评价玉屏风丸的质量，本研究中采用高效液相色谱（HPLC）法建立了玉屏风丸指纹图谱，并结合聚类分析，对各色谱峰所代表的化学成分进行了初步归属，建立同时测定其7 个主要成分指标（毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、升麻素苷、升麻素、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ）的定量检测方法，以期为系统和准确评价其质量提供技术参考。现报道如下。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters 2695 型高效液相色谱仪，包括2695 型四元梯度泵、2695 型自动进样器、2489 型紫外可见光检测器、Empower3 色谱工作站，美国沃特世公司）；AUW-220D 型电子天平（日本岛津公司，精度为0.01 mg）；KQ-250DB 型数控超声波清洗器（昆山超声波仪器有限公司，功率为500W）。

1.2 试药

毛蕊异黄酮葡萄糖苷（calycosin7-O-β-D-glucopyranoside，批号为111920-201606，含量97.6%），芒炳 花 素（formononetin，批 号 为111703-201504，含 量100%），升麻素苷（prim-O-glucosylcimifugin，批号为111522-201712，含量96.2%），升麻素（cimifugin，批号为 111710-200602，含量 95.5% ），白术内酯Ⅲ（atractylenolide Ⅲ，批号为 111978-201501，含量99.9% ），白术内酯Ⅱ（atractylenolide Ⅱ，批号 为111976-201501，含量 99.9% ）、白术内酯Ⅰ（atractylenolide Ⅰ，批 号 为 111975-201501，含 量99.9%），各对照品均购自中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇（美国Merck 公司）均为色谱纯；磷酸为分析纯；水为娃哈哈纯净水。玉屏风丸（市售，14 批，编号为S1 ～S14，S1 ～S10 为山西华康药业股份有限公司生产，规格为6 g×10 袋/盒，批号分别为20171212，20180105，20180207，20180313，20180408，20180518、20180626，20180912，20181019，20181115；S11 ～S14 为厦门福满药业有限公司生产，规格为6 g×18 袋/盒，批号分别为180906，181022，181108，181201）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件[7 -9]

色谱柱：Shim-pack VP-ODS 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.3%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0 ～20 min 时12%A，20 ～40 min 时12%A→35%A，40 ～46 min 时35%A→68%A，46 ～50 min 时68%A→80%A，50 ～60 min 时80%A→12%A）；波长：300 nm（0 ～2 min，升麻素苷），254 nm（20 ～40 min，毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素及升麻素），220 nm（40 ～46 min，白术内酯Ⅲ及白术内酯Ⅱ），275 nm（46 ～60 min，白术内酯Ⅰ）；柱温：35 ℃；流速：0.85 mL/min；进样量：10 μL。

2.2 溶液制备

分别取毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、升麻素苷、升麻素、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ对照品各适量，精密称定，以85%甲醇溶解并定容，制成质量浓度分别为0.786 6，0.411 2，0.434 7，0.310 8，0.379 5，0.264 5，0.200 3 mg/mL 的混合对照品溶液。取装量差异项下的样品内容物，研细，取粉末约3.0 g，精密称定，置50 mL 棕色容量瓶中，加入85%甲醇溶液35 mL，室温超声处理（功率为450 W，频率为40 kHz）45 min 后取出，放冷，用85%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，即得供试品溶液。均室温避光保存。

2.3 指纹图谱的建立及分析

2.3.1 方法学考察

精密度试验：取同一批（批号为20180912）样品，按

2.2 项下方法制备供试品溶液，按拟订色谱条件连续进样6 次，记录色谱图。结果以毛蕊异黄酮葡萄糖苷为参比峰，计算得各相对峰面积的RSD均小于0.8%（n=6），共有峰相对保留时间的RSD均小于0.6% （n=6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批（批号为20180912）样品，按2.2 项下方法平行制备供试品溶液6 份，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图。结果以毛蕊异黄酮葡萄糖苷为参比峰，计算得各相对峰面积的RSD均小于1.2%（n=6），共有峰相对保留时间的RSD均小于0.9%（n=6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取同一批（批号为20180912）样品，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按拟订色谱条件分别于0，4，8，12，16，20，24 h 时进样，记录色谱图。结果以毛蕊异黄酮葡萄糖苷为参比峰，计算得各相对峰面积的RSD均 小 于1.0% （n=7），共 有 峰 相 对 保 留 时 间 的RSD均小于0.7% （n=7），表明玉屏风丸供试品溶液在24 h 内稳定。

2.3.2 指纹图谱的建立及相似度评价

按2.2 项下方法制备14 批供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图。结果见图1 至图3。将14份指纹图谱依次导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012A 版）软件，以S4 号玉屏风丸供试品溶液的指纹图谱作为参照图谱，设定时间窗宽度为0.3，采用多点校正全谱匹配，生成指纹图谱共有模式，并计算各图谱与共有模式的相似度。结果14 批样品的指纹图谱中，共得到18 个共有峰，14 批指纹图谱的相似度分别为0.994，0.995，0.999，0.998，0.997，0.996，0.991，0.993，0.992，0.995，0.989，0.979，0.988，0.990，均 大 于0.97。

图1 14 批样品高效液相色谱叠加指纹图谱

图2 玉屏风丸高效液相色谱对照品指纹图谱

2.3.3 部分共有峰指认及相对峰面积计算

将指纹图谱与2.3.2 项下混合对照品溶液色谱图进行比对，以保留时间为评价指标，指认出共有峰中7 种化合物，分别为4 号（升麻素苷）、9 号（毛蕊异黄酮葡萄糖苷）、10 号（升麻素）、11 号（芒柄花素）、16 号（白术内酯Ⅲ）、17 号（白术内酯Ⅱ）和18 号（白术内酯Ⅰ），其保留时间 平 均 值 分 别 为13.18，28.04，30.11，31.96，44.02，45.89，47.95 min。其中9 号峰信号最强，位置居中，选为参照峰，计算各共有峰的相对峰面积。结果见表1。

2.4 含量测定

2.4.1 方法学考察

线性关系考察及检测限和定量限测定：分别精密吸取2.2 项下混合对照品溶液1，2，5，10，15，20 μL，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图。以各组分对照品进样量（X，μg）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，绘制标准曲线，计算各组分线性回归方程及相关系数。取2.2 项下混合对照品溶液，用85%甲醇逐步稀释，按各组分色谱峰信噪比（S/ N）=3 ∶1 及10 ∶1 分别测定其检测限（LOD）和定量限（LOQ）。结果见表2。

精密度试验：取混合对照品溶液，按拟订色谱条件连续进样6 次，记录峰面积。结果见表2，表明仪器精密度良好。

表1 14 批玉屏风丸（S1 ～S14）共有峰的相对峰面积

表2 玉屏风丸中7 个组分含量测定方法学考察结果

图3 混合对照品溶液高效液相色谱图

稳定性试验：取同一批（批号为20180912）样品，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按拟订色谱条件分别于0，3，6，9，12，18，24 h 时进样，记录峰面积。结果见表2，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

重复性试验：取同一批（批号为20180912）样品6 份，按2.2 项方法平行制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积。结果见表2，表明方法重复性良好。

加样回收试验：取同一批（批号为20180912）已知含量玉屏风丸粉末6 份，每份1.5 g，精密称定，置具塞棕色容量瓶中，精密加入含毛蕊异黄酮葡萄糖苷1.214 7 mg/mL、芒柄花素0.310 9 mg/mL、升麻素苷0.341 1 mg/mL、升麻素0.235 3 mg/mL、白术内酯Ⅲ0.290 6 mg/mL、白术内酯Ⅱ0.199 9 mg/mL 和白术内酯Ⅰ0.154 7 mg/mL的混合对照品溶液2.0 mL，按2.2 项下方法制备供试品溶液，摇匀，滤过，按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积，计算各组分加样回收率。结果见表3。

2.4.2 样品含量测定

取S1 ～S14 号玉屏风丸，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图，按外标法分别计算各成分的含量。结果见表4。

2.5 系统聚类分析[10 -11]

系统聚类分析作为一种统计分析方法，是在相似性的基础上收集数据来分类。以14 批样品中18 个共有峰的相对峰面积为变量，采用SPSS 22.0 软件聚类法中Ward 方法对样品进行系统聚类分析，采用组间平均数联结法，以欧氏距离平方为测度。结果见图4。可见，当类间距为10 ～25 时，14 批样品可聚为两大类，第一类为S3，S9，S4，S5，S1，S6，S8，S2，S10，S7；第二类为S12，S14，S11，S13。第一类均为山西华康药业股份有限公司产品，第二类均为厦门福满药业有限公司产品，说明同一厂家产品的质量稳定性较高。

3 讨论

3.1 测定目标成分选择

黄芪作为玉屏风丸的君药，占总处方量的60%，具有利水消肿、行滞通痹、托毒排脓、敛疮生肌之功效，来源于豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao 或膜荚黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge. 的干燥根，主要活性成分为黄酮类（毛蕊异黄酮葡萄糖苷及芒柄花素）、异黄酮类及其苷类、皂苷类等化合物[12-13]。方中臣药防风含有色原酮、挥发油及多糖类等有效成分，其中色原酮类具有解热、镇痛、抗炎、抗肿瘤等多种功效，故选取升麻素苷、升麻素作为制剂中防风药材的质控指标[14-15]。白术健脾益气，助黄芪以加强益气固表之功效，为佐药，特征成分白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ及白术内酯Ⅰ在HPLC图中可清晰分辨[16-17]。

表3 玉屏风丸7 组分加样回收试验结果（n=6）

3.2 色谱条件优化

本研究中对样品提取方法（超声、浸渍过夜、回流）、提取溶剂（甲醇、85%甲醇、65%甲醇、55%甲醇）、提取时间（25，35，45 min）、流动相（甲醇、乙腈作为有机相，水、0.1%磷酸溶液、0.3%磷酸溶液、0.5%磷酸溶液、0.5%冰醋酸作为水相）、柱温（25，30，35 ℃）进行了详细考察，结果显示，85%甲醇作溶剂，超声处理45 min，柱温35 ℃，流动相为乙腈-0.5%磷酸溶液梯度洗脱时基线平稳，保留时间适中，指纹图谱色谱峰数量多且分离效果佳，各色谱峰峰形好。采用DAD 检测器在190 ～400 nm 波长处扫描，为使各成分均在其最大吸收波长下进行测定，采用不同时段切换不同检测波长：0 ～20 min时设定检测波长为300 nm，测定升麻素苷；20 ～40 min时设定检测波长为254 nm，检测毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素及升麻素；40 ～46 min 时设定检测波长为220 nm，检测白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ；46 ～60 min 时设定检测波长为275 nm，检测白术内酯Ⅰ。

表4 玉屏风丸中7 组分含量测定结果（mg/g，n=3）

图4 14 批玉屏风丸聚类分析树状图

3.3 方法评价

基于中成药的质量控制的特点，本研究中建立了玉屏风丸指纹图谱，实现了对其多指标成分进行整体综合的客观评价与分析，保证药效的稳定性；同时又建立毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、升麻素苷、升麻素、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ的含量测定方法，实现玉屏风丸的定量分析。该方法前处理条件简便、快捷，测定结果准确、重复性好、实用性强，同时具备定性和定量双重评价功能，可有效控制玉屏风丸的质量。