参鹿补片质量标准研究
2020-03-15黄武军付向红邹国辉
黄武军，付向红，邹国辉
（仁和＜集团＞发展有限公司，江西 樟树 331200）
参鹿补片组方为红参、鹿肉、淫羊藿、狗脊、墨旱莲、玉竹等14 味中药材，原标准中已有齐墩果酸的薄层色谱（TLC）鉴别法[1]。采用乙醚作为提取溶剂，乙醚的穿透力低，不能充分提取出齐墩果酸，供试品色谱中齐墩果酸斑点淡，拖尾严重，且比对照品色谱中相应斑点偏高，此情况易出现对结果判定产生分歧，故对供试品的处理方法、展开剂及显色方法进行了修订。为了更有效地控制该品的质量，本研究中对参鹿补片进行了定性定量研究，不仅对齐墩果酸的TLC 鉴别方法进行了修订，还采用TLC 法对人参皂苷Rg1进行定性鉴别，高效液相色谱（HPLC）法测定淫羊藿苷含量，旨在为该制剂的质量控制提供参考。现报道如下。
1 仪器与试药
1.1 仪器
高效液相色谱仪：Agilent 1200 型（美国安捷伦公司）；岛津LC-20AD 型（日本岛津公司）。色谱柱：Diamonsil（钻石1 代）C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；Diamonsil（2）C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Spurisil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。CP224S 型电子天平（d=0.1 mg），CP225D 型电子天平（d=0.01 mg，0.1 mg），均购自赛多利斯公司。
1.2 试药
齐墩果酸对照品（批号为110709-200505），人参皂苷Rg1对照品（批号为110703-201027，含量以97.7% 计），淫羊藿苷对照品（批号为110737-200415），均购自中国食品药品检定研究院；参鹿补片（批号分别为150301，150302，150303），不含红参、女贞子、淫羊藿的阴性样品，均由江西药都仁和制药有限公司提供；硅胶G 薄层板（批号为20161014，青岛海洋化工厂）；乙腈、甲醇均为色谱纯（购自美国天地公司）；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 薄层色谱鉴别
齐墩果酸[2]45-46，429-430，496-497，526，949-950，1258，1366[3-4]：取样品10 片，研细，加2%的氢氧化钠溶液30 mL，超声处理30 min，离心（3 000 r/min，5 min），上清液用盐酸调pH 为2 ～3，用乙醚振摇提取2 次，每次30mL，合并乙醚提取液，蒸干，残渣加甲醇1 mL 使溶解，作为供试品溶液。另按处方取除女贞子的其他药材制成阴性样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。取齐墩果酸对照品，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法[2015 年版《中国药典（一部）》通则0502]，吸取上述3 种溶液各5 μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G 薄层板上，以环己烷-丙酮-乙酸乙酯（5 ∶2 ∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与齐墩果酸对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。详见图1 A。
人参皂苷Rg1[2]440-442，446-447，864-865，868，1124-1126，1276-1278[5]：取样品10 片，研细，加甲醇40 mL，水浴回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加水30 mL 使溶解，加水饱和正丁醇振摇提取2 次，每次30 mL，合并正丁醇提取液，用正丁醇饱和的水50 mL 洗涤，弃去水洗液，正丁醇蒸干，残渣加甲醇1 mL 使溶解，作为供试品溶液。另按处方取除红参的其他药材制成阴性样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。再取人参皂苷Rg1对照品，加甲醇制成每1 mL 中含1 mg 的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法[2015 年版《中国药典（一部）》通则0502]，吸取上述3 种溶液各5 ～10 μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13 ∶7 ∶2）10 ℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与人参皂苷Rg1对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。详见图1 B。
图1 薄层色谱图
2.2 淫羊藿苷含量测定[2]327-328，1095-1096，1098，1369-1370[6-8]
2.2.1 色谱条件与系统适用性试验
色谱柱：烷键合硅胶为填充剂；流动相：乙腈-水（29 ∶71）；检测波长：270 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；柱温：35 ℃。在此条件下的色谱图见图2。理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于2 000，且分离度大于1.5。
2.2.2 溶液制备
取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，用稀乙醇制成每1 mL 中含10 μg 的溶液，作为对照品溶液。取本品20 片，精密称定，研细，取约2 g，精密称定，置50 mL 容量瓶中，加入稀乙醇40 mL，超声处理（功率350 W，频率35 kHz）1 h，放冷，用稀乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。另按处方取不含淫羊藿的其他药材制成阴性样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。
2.2.3 方法学考察
专属性试验：分别吸取2.2.2 项下3 种溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图。结果淫羊藿苷峰能较好地分离，保留时间适中，阴性无干扰，专属性好。详见图2。
线性关系考察：取淫羊藿苷对照品10.46 mg，精密称定，置100 mL 容量瓶中，加稀乙醇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，得母液（104.6 μg/mL），再分别精密吸取1.0，3.0，5.0，7.0，9.0 mL，分别置50 mL 容量瓶中，用加稀乙醇稀释成不同质量浓度的对照品溶液。按拟订色谱条件进样10 μL，记录峰面积。以淫羊藿苷的质量浓度（X，μg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=46.214X-1.720，r2=1.000（n=6）。结果表明，淫羊藿苷质量浓度在2.092 ～18.828 μg/mL 范围内与峰面积线性关系良好。
精密度试验：取同一对照品溶液（质量浓度为10.46 μg/mL），连续进样6 次，记录峰面积。结果的RSD为0.39%（n=6），表明仪器精密度良好。
稳定性试验：取同一供试品（批号为150301）溶液，分别于放置0，2，4，6，8，10，12，24 h 时进样测定，记录峰面积。结果的RSD为1.7%（n=8），表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。
图2 高效液相色谱图
重复性试验：取供试品（批号为150301）6 份，按含量测定项下方法试验，测定淫羊藿苷的含量。结果6 份样品中淫羊藿苷平均含量为240.04 μg/g，RSD为1.3%（n=6），表明方法重复性良好。
加样回收试验：取本品（已知淫羊藿苷含量为240.04 μg/g）1 g 共6 份，精密称定，分别定量加入淫羊藿苷对照品溶液，测定淫羊藿苷的含量，计算回收率。结果见表1。
表1 加样回收试验结果（n=6）
耐用性试验：在不同时间、不同人员分别采用不同的高效液相色谱仪及不同的色谱柱，改变色谱条件，如温度（35±5）℃、流速（1.0±0.2）mL/min、流动相比例±5%情况下，对同一批样品进行测定。结果淫羊藿苷峰均能达到基线分离，RSD为1.7%（n=5），表明方法耐用性良好。
3 讨论
3.1 TLC 鉴别试验条件选择
齐墩果酸为三萜类皂苷元。本试验中，采用甲醇、氯仿、乙醚超声或回流提取，斑点不清晰；采用氢氧化钠溶液超声提取，可水解生成皂苷元（采用酸水解会发生脱水、环合、双键转移等），再用盐酸溶液调至酸性，用有机溶液剂萃取，结果斑点清晰、圆整、分离好。比较了不同展开剂的分离效果，如环己烷-丙酮-乙酸乙酯（5 ∶2 ∶1）、三氯甲烷-甲醇-甲酸（40 ∶1 ∶1）、甲苯-乙酸乙酯-醋酸（5 ∶1 ∶1）上层溶液等，以环己烷-丙酮-乙酸乙酯（5 ∶2 ∶1）的分离效果为佳。
参鹿补片中红参为药材原粉入药，其中的人参皂苷Rg1易溶于醇，故用甲醇回流提取，更易穿透细胞壁，提取充分；但参鹿补片含有大量的水溶性成分，故甲醇提取液蒸干后，残渣加水使溶解，用正丁醇提取，再用水洗涤正丁醇提取液，进一步排除了杂质的干扰。比较了不同展开剂的分离效果，如三氯甲烷-甲醇-水（13 ∶7 ∶2）10 ℃以下放置的下层溶液、三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15 ∶40 ∶22 ∶10）10 ℃以下放置的下层溶液，以三氯甲烷-甲醇-水（13 ∶7 ∶2）10 ℃以下放置的下层溶液的分离效果为佳。
3.2 含量测定指标及HPLC 条件选择
参鹿补片处方由14 味中药材组成，红参为君药，主含人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1，原药材已有含量控制。同为君药的鹿肉，主要含有蛋白质、脂肪、无机盐、糖和一定量的维生素，选择此类成分作为含测指标无针对性。故选择臣药淫羊藿中淫羊藿苷作为含量测定指标。本试验中比较了不同体系和比例的流动相，如甲醇-水（60 ∶40）、乙腈-水（30 ∶70）等，结果采用乙腈-水（29 ∶71）时淫羊藿苷峰形对称、基线平稳，分离效果良好；比较了不同提取溶剂，如甲醇、乙醇、50%甲醇溶液、稀乙醇制备供试品溶液，结果采用甲醇、乙醇时峰对称性差，兼顾环保考虑，选择稀乙醇作为提取溶剂；比较了超声处理及加热回流的处理方式，含量结果无明显差异，故选择简单、快捷、常温的超声处理方法。
由于不同产地、不同批次的淫羊藿中淫羊藿苷含量高低不同[9-15]，根据多批次样品检测结果统计，参鹿补片中淫羊藿苷的含量定为应不低于每片60 μg 为佳。
