家兔体内泊那替尼固体脂质纳米粒药代动力学研究

熊远果，高洁芳，沈 瑶，张 洪

（武汉大学人民医院药学部，湖北 武汉 430060）

泊那替尼（ponatinib）是继第1 代酪氨酸酶抑制剂（TKI）伊马替尼和第2 代达沙替尼之后的新一代替尼类药物，主要用于成人耐药性慢性粒细胞白血病和费城染色体阳性的急性淋巴细胞白血病的治疗，包括难抑制的T315I 突变[1]，且对加速期耐药性白血病也有一定的临床效果。药理学试验证明，泊那替尼通过与三磷酸腺苷（ATP）竞争BCL-ABL 融合蛋白中结合位点，从而抑制融合蛋白的表达[2]。但目前泊那替尼上市制剂为仅为口服速释片，其不良反应率高，严重限制了其临床应用范围[3-4]。固体脂质纳米粒（SLN）是近年来兴起的以类脂材料为核心的纳米粒给药体系[5]。其脂质材料具有良好的生物相容性和靶向性，缓控释效果显著，可降低药物的毒副作用[6-7]，且具有较好的稳定性，可用于多种不同的给药途径，并可进行大规模工业生产等优点，应用前景广泛[8-10]。为促进泊那替尼更安全、有效地用于临床，本研究中拟将前期制备的泊那替尼固体脂质纳米粒（P-SLN）混悬液进行家兔体内药代动力学试验，探讨新剂型在体内的缓控释效果及生物利用度，为开发泊那替尼新剂型提供研究基础。现报道如下。

1 仪器、试药与动物

1.1 仪器

岛津L20 型高效液相色谱仪（UV 检测器，日本岛津公司）；TG328A 型电子分析天平（上海天平仪器厂）；Vortex-2 型涡旋仪（上海沪析实业有限公司）；3K30 型冷冻高速离心机（德国Sigma 公司）。

1.2 试药

泊那替尼（武汉星耀艾克生物医药有限责任公司，批号为06771，含量99.0%）；泊那替尼对照品（上海翰香生化制品有限公司，批号为20121226，含量99.3%）；泊那替尼固体脂质纳米粒（自制）；肝素钠注射液（天津市生物化工制药厂）；甲醇、乙腈均为高效液相色谱（HPLC）纯（美国天地公司）；水为超纯水（实验室自制）；其他试剂均为分析纯。

1.3 动物

新西兰兔12 只，体质量（2.0±0.5）kg，雌雄各半，购自武汉大学动物实验中心，动物实验合格证号为SCXK ＜Hubei ＞2014-0201。动物实验符合动物实验伦理委员会《实验动物福利伦理原则》要求。

2 方法与结果

2.1 P-SLN 制备

取泊那替尼10 mg、单硬脂酸甘油酯50 mg、蛋黄卵磷脂100 mg，精密称定，于（75±2）℃水浴溶于5 mL 的无水乙醇形成有机相。另取150 mg 泊洛沙姆188，溶于10 mL 蒸馏水中，构成水相。将有机相加入水相中，于10 000 r/min 高速乳化10 min，并于等温1 000 r/min继续搅拌15 min，除去有机相。随后快速分散于比例为1 ∶5 的0 ～2 ℃水分散相中，于10 000 r/min 高速均质10 min，即得P-SLN 混悬液。制备的P-SLN 平均粒径为（155.1±4.32）nm，PDI 为（0.152±0.009 0），Zeta 电位为（ -22.0±1.71）mV，包封率为（67.73±1.84）%（n=3）。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件

据预试验及参考文献[11]，确定检测条件。色谱柱：Agilent Zorbax Extend C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.2%三乙胺乙酸缓冲盐（78 ∶22，pH=7）；检测波长：280 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。

2.2.2 溶液制备

取泊那替尼对照品10 mg，精密称定，置100 mL 容量瓶中，加入适量无水乙醇上下振荡溶解，定容至刻度，即为100 μg/mL 的对照品贮备液，分别取适量，置10 mL容量瓶中，配制成质量溶度为0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 μg/mL 系列质量浓度梯度的对照品溶液。取一定量的泊那替尼对照品，精密称定，加入适量0.5%羟甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液，涡旋混匀，即得对照组泊那替尼对照液，作为对照组动物灌胃液。精密量取一定量P-SLN，直接加入生理盐水配制成均匀溶液，即制剂组P-SLN 溶液，作为给药组动物灌胃液。

2.2.3 血清样品处理

取新西兰兔全血，置经肝素钠处理后的离心管中，于低温4 ℃下，10 000 r/min 冷冻离心10 min，取离心后的上清液，作为空白血清样品。精密量取200 μL 血清样品，加入200 μL 冷甲醇沉淀蛋白，涡旋振荡混合5 min，于10 000 r/min 离心15 min，取上清液20 μL 过0.45 μm尼龙膜滤过后进样。

2.2.4 方法学考察

专属性试验：取新西兰兔空白血样、空白血样，加适量泊那替尼对照品溶液和给药后血样样品，按照2.2.3项下方法处理后，按拟订色谱条件进样，得色谱图（见图1）。结果表明，在此条件下，空白血样对样品含量测定无干扰，该方法专属性好。

线性关系考察：精密量取适量质量浓度的对照品溶液，置试管中，氮气吹干，取空白血样200 μL，涡旋混匀，制成血药浓度为0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 μg/mL 的样品，按2.2.3 项下方法处理后，按拟订色谱条件进样，记录色谱图，计算峰面积。以测定血样峰面积平均值（A）对血样浓度（C，μg/mL）进行线性回归，得回归方程A=20 067C-1 347，r=0.999 4 （n=5）。结果表明，泊那替尼血样质量浓度在0.2 ～10.0 μg/mL 范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取适量泊那替尼对照品溶液，氮气吹干，加入空白血浆，分别精密配制高、中、低（5.0，1.0，0.2 μg/mL）3 种不同质量浓度的血样溶液，按2.2.3 项下方法处理后，按拟订色谱条件进样，于1 d 内连续进样5 次，不同天内，每天进样1 次，连续5 d，记录色谱图进行计算。结果日内精密度的RSD分别为1.14%，0.90%，1.83% （n=5），日间精密度的RSD为0.25%，1.25%，1.37%（n=5）。

提取回收率试验：取适量泊那替尼对照品溶液，氮气吹干，加入空白血浆，分别精密配制高、中、低（5.0，1.0，0.2 μg/mL）3 种不同质量浓度的血样溶液，按2.2.3 项下方法处理后，按拟订色谱条件进样，记录色谱图。同时，取相同质量浓度未经过处理的对照品溶液进样，记录色谱图。计算提取回收率，每个试验重复3 次。结果平均加收率分别为85.69%，87.95% ，86.45%，RSD为3.40%，6.32%，5.92%，表明该方法提取回收率满足生物样品测定要求。

方法回收率试验：取适量泊那替尼对照品溶液，氮气吹干，加入空白血浆，分别精密配制高、中、低（5.0，1.0，0.2 μg/mL）3 种不同质量浓度的血样溶液，按2.2.3 项下方法处理后，按拟订色谱条件进样，记录色谱图，代入标准曲线，得到对应质量浓度，与加入的已知质量浓度相比，计算方法回收率，每个试验重复3 次。结果平均加收率分别为97.02%，103.13%，105.33%，RSD为2.17%，5.50%，3.52%，表明方法回收率满足生物样品测定要求。

图1 高效液相色谱图

2.3 药代动力学试验

将12 只健康新西兰兔，雌雄各半，随机分为2 组，每组6 只。给药前，动物均禁食12 h，按15 mg/kg 剂量分别给对照组和给药组动物灌胃给药泊那替尼对照品溶液和P-SLN 溶液。给药后，分别于0.5，1.0，1.5，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0，24.0 h 耳缘静脉取血2.0 mL。所取的全血样品置肝素化的离心管中，于低温4 ℃下10 000 r/min 冷冻离心10 min，取上清液保存于-20 ℃冰箱内。

将上述采集的血样，按照2.2.3 项下方法处理后，按拟订色谱条件进样，记录色谱图，代入标准曲线，测定不同时间点的血药浓度。以时间为横坐标（）、血药浓度为纵坐标（Y），作P-SLN 的药-时曲线，详见图2。对所测得的血药浓度数据，采用DAS 2.0 药代动力学软件进行拟合，得对照组和制剂组的药代动力学参数，详见表1。采用SPSS 20.0 统计学软件对所得参数进行t检验。由图2 和表1 可见，与对照组比较，P-SLN 溶液在口服后，其药时曲线下面积（AUC）是对照组的3.39 倍，AUMC 为14.87 倍，平均滞留时间（MRT）是4.55 倍，半衰期（t1/2）为4.44 倍，清除率（CL）为0.29 倍（P＜0.001）。结果显示，将泊那替尼制成固体脂质纳米粒后，其生物利用度显著提高，体内滞留时间增加，清除率降低，半衰期延长，缓释效果显著，达到了试验预期目标。

图2 P-SLN 药-时曲线图（n=6）

表1 P-SLN 口服给药后药代动力学参数（±s，n=6）

表1 P-SLN 口服给药后药代动力学参数（±s，n=6）

注：与对照组相比，*P ＜0.001，#P ＜0.01。

项目AUC[（μg/mL）·h]AUMC（μg/mL）MRT（h）t1 /2（h）CL [（mg/kg）/h/（μg/mL）]V（L/kg）对照组3.53±0.21 9.38±2.26 2.63±0.59 1.82±0.41 4.26±0.24 11.12±1.92给药组11.98±0.74*139.44±6.75*11.65±0.27*8.08±0.19*1.26±0.080*14.66±1.26#

3 讨论

泊那替尼作为一种全新的小分子药物，上市时间较短，目前对其在体内血药浓度检测的方法学报道较少。本研究中在前期试验的基础上，进一步优化了检测条件，结果显示，优化后的HPLC 法准确性、专属性和重复性均表现良好。相较于LC-MS 法[12]及酶联免疫吸附法（ELISA）[13]，该方法避免了对精密仪器的依赖和昂贵专用试剂的使用，操作简单，成本较低，适用于大规模临床血样浓度的测定。

本研究中，血药浓度检测受到血样蛋白的干扰较大。根据参考文献[14]，主药泊那替尼与血清蛋白结合率为99%，故前期对蛋白的处理尤其重要。试验选用了不同比例的甲醇、乙腈、氯仿等多种溶剂沉淀血清蛋白，结果显示，等体积的甲醇除蛋白效果良好。一方面避免了样品过度稀释，降低了检测限；另一方面避免了高危溶剂的使用，保护了试验者的安全。同时，还研究了萃取法对试验影响，结果显示，液-液萃取降低了血药中的主药含量，且相关蛋白未能除尽，影响检测结果的准确，故最终确定采用等体积甲醇处理样品。

药代动力学试验中，给药组药-时曲线显示有2 个吸收峰。第1 个峰为吸附在纳米粒表面的泊那替尼释药吸收，第2 个峰为包封于固体脂质纳米粒核心的主药的释放[15]。2 个吸收峰之间的峰谷，可能与淋巴细胞的清除有关[16]。在释药的后期，给药组消除速率慢于对照组，表明在内环境中，纳米粒释药速率减慢，药物的清除率降低，滞留时间延长，缓释效果明显[17-18]。结果显示，将泊那替尼制成固体脂质纳米可提高其在家兔体内的生物利用度。

在动物实验过程中，对照组动物表现为活动范围缩小、活动频率降低、欲望减弱，并伴有腹泻现象。给药组未出现相关现象，且在活动范围频率上表现为前后无明显差异，同时未观测到有胃肠道不良反应发生，表明将泊那替尼包封于脂质纳米粒内可降低其在体内的不良反应。另外，本研究结果显示，脂质纳米粒的生物利用度显著高于对照组，可在保证相同的生物利用度上，降低单次给药剂量，且可进一步降低不良反应的发生率。