枯草芽孢杆菌DNKAS对加工番茄分枝列当的防治应用

崔华星,王宁,侯敏,许俊锋,郭文超,安康,陈阳辉,崔卫东*

(1.新疆大学生命科学与技术学院, 乌鲁木齐 830001； 2.新疆农业科学院微生物应用研究所,乌鲁木齐 830001；3.新疆农业科学院新疆特殊环境微生物试验室， 乌鲁木齐 830001；4.北京达农生物科技有限公司， 北京 100043)

分枝列当(Orobancheaegyptiaca)是多年生、两年生或一年生肉质寄生草本，可广泛寄生于西瓜、甜瓜、向日葵、加工番茄等作物上，会吸收寄主养分、生长激素和水分以维持自身生长，导致寄主作物生长缓慢、抵御病虫害能力降低、作物产量和品质下降、减产甚至绝收[1-2]。新疆维吾尔自治区是受分枝列当肆虐最严重的地区之一，遍布南北疆各地，严重危害加工番茄种植加工产业，每年受分枝列当影响的加工番茄种植面积约为7 000 hm2 [3]，个别地块寄生率达100%，导致加工番茄绝收。

目前，分枝列当主要防治措施有调整播期[4]、播种捕获作物或诱捕作物[5]、土壤深耕[6]、培育抗性品种[7]、化学防治[8-9]等。然而，单一使用这些防治措施效果都不理想。调整播期和播种捕获或诱捕作物虽然可以减轻列当危害，但在一些地区由于气候原因很难执行；土壤深耕十几年内只能用一次，防治效果降低；培育抗性品种是防治分枝列当的有效措施之一，由于我国对加工番茄抗分枝列当品种选育的研究相对滞后，且抗性品种影响加工番茄部分指标，形成成熟品种非常困难；化学防治不仅会污染土壤，而且剂量使用不当也会影响寄主作物生长[10]。微生物防治具有防治效果好[11]、环境友好、不易产生耐药性、提高作物产量[12]、可在列当出土前进行防治[13]等特点，有利于发展可持续性农业，越来越引起人们的重视。

生防菌是防治列当的重要方法之一。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)广泛应用于植物病防治，并取得良好效果，但用于列当防治的研究较少。了解枯草芽孢杆菌在大田中的代谢情况，有利于枯草芽孢杆菌对列当的防治应用。Biolog-ECO技术是根据微生物单一碳源代谢表型进行分析，通过对数字化的平板图像进行颜色响应来研究微生物的代谢功能多样性[14-15]。顾美英等[16]通过Biolog-ECO技术分析不同腐烂病发病程度核桃根区土壤，发现腐烂病发病程度较重的土壤中微生物活性低于健康和腐烂病发病程度较轻的土壤。当前，关于枯草芽孢杆菌在列当田中代谢情况研究，鲜有报导。本研究选用枯草芽孢杆菌DNKAS菌株作为生防菌，通过皿内种子发芽抑制试验来验证其抗列当性能，随后为掌握大田中菌种施用的最佳剂量，从微生物群落系统功能角度，运用Biolog-ECO 技术分析不同处理条件下的土壤微生物功能多样性、碳源利用情况和微生物代谢多样性的关系，为枯草芽孢杆菌更好地防治分枝列当提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

试验菌株为枯草芽孢杆菌DNKAS，由北京达农生物科技有限公司提供；人工合成独脚金内酯类似物GR24，购自北京酷来搏科技有限公司；DNKAS菌粉，由北京达农生物科技有限公司生产，施用剂型为可湿性粉剂，活菌数达 1×1011CFU·g-1；黄腐酸钾，购自新疆双龙腐植酸有限公司；番茄品种为‘TH1601’，由中粮吉木萨尔番茄公司提供；NA、NB和PDA培养基，均购自青岛高科园海博生物技术有限公司。

1.2 样品采集

试验地点位于新疆维吾尔自治区昌吉回族自治州吉木萨尔县(N43°59′51″, E89°4′45″)，属中温带大陆干旱气候，冬季寒冷、夏季炎热，降雨量少，昼夜温差大，平均年日照时数为2 861.1 h，年平均气温7.0 ℃。品质检测所用材料为各处理的成熟加工番茄果实，所需样品土壤采集自去除表层深10～20 cm的根际土壤，四分法采样后放入PE袋中带回，放入4 ℃冰箱保存，用于微生物及土壤理化性质分析。

1.3 仪器与设备

SPX-420BF-2生化培养箱，上海福玛试验设备有限公司；1506Biolog-ECO 板和微生物自动鉴定系统，美国 Biolog 公司；JP-150Y超声波细胞粉碎机，无锡久平仪器有限公司；L6S分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；DFY300A捣碎机，无锡莱浦仪器设备有限公司；TD-380折射仪，上海双旭电子有限公司；YS6060番茄红素色差仪，深圳市三恩时科技有限公司；CT-6321 pH计，上海仪电分析仪器有限公司；HK2玻璃糖浆锤度计, 潍坊祥意化工有限公司；MZ101体式显微镜，广州市明美光电技术有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1皿内芽管生长抑制试验 ①分枝列当种子的表面消毒和预培养。将分枝列当种子用质量体积比1∶100的次氯酸钠溶液和75%的乙醇中分别超声清洗5.0 min。用无菌水冲洗至无色后将分枝列当种子置于超净工作台自然晾干。先将直径为8.0 mm的玻璃纤维滤纸片摆放于事先放有2层湿润普通定性滤纸的直径为9.0 cm的培养皿中，随后将己经晾干的分枝列当种子均匀撒于玻璃纤维滤纸片上，每个滤纸片上约40～70粒种子。将上述培养皿封口后置于25 ℃的黑暗环境下培养5 d，待用。

②无细胞发酵液制备。首先，将DNKAS菌株接种于NA培养基中，于37 ℃培养24 h。随后，挑取适量菌株接种至己灭菌、装有50.0 mL NB培养基的200 mL三角瓶中。用培养膜封口后，将上述三角瓶放置于37 ℃、150 r·min-1的摇床中振荡培养，同时以不接种微生物的NB液体培养基作为对照。振荡培养18 h后，取三角瓶中的培养液30 mL，5 500 r·min-1离心7 min，离心后的菌液经0.45 nm微孔滤膜过滤。过滤后瓶中的无细胞发酵滤液视为原液。将无细胞发酵滤液原液稀释10、100、1 000倍后，备用。

③菌体水提取液制备。离心后的菌体加无菌水至30 mL，经超声细胞粉碎机粉碎，粉碎后的菌液经0.45 nm的微孔膜过滤视为原液，原液稀释10、100、1 000倍后，备用。

④菌体甲醇提取液制备。离心后的菌体加甲醇至30 mL, 经超声细胞粉碎机粉碎，粉碎后的菌液经0.45 nm的微孔膜过滤视为原液，原液稀释10、100、1 000倍后，备用。

列当芽管长度用明美显微镜成像系统自带测量软件进行测量。

⑤分枝列当种子芽管萌发试验。萌发试验设置4个处理，分别为0.1 mg·L-1GR24(GR24)、无细胞发酵滤液(CF)、菌体甲醇提取液(BM)和菌体水提取液(BW)，其中，GR24为分支列当种子的萌发刺激物；菌体甲醇提取液为，取30 μL菌体甲醇提取液，待甲醇挥发后，加30 μL无菌水。同时，将无细胞发酵滤液、菌体水提取液和菌体甲醇提取液分别稀释为1、10、100、1 000倍。将一片直径为8.0 mm的玻璃纤维滤纸片摆放于培养皿中，依次添加30 μL种子萌发处理液和1片己经预培养好的分枝列当种子片于上述玻璃纤维滤纸片上。培养皿中部放1张对折3次的湿润滤纸片保湿，然后将培养皿用封口膜封口。各处理6片重复。随后将培养皿置于25 ℃黑暗环境下培养，9 d后，用显微镜观察分枝列当种子芽管生长情况。

1.4.2田间小区试验 设置清水对照(CK)、3 kg·hm-2DNKAS菌剂(D3)、4.5 kg·hm-2DNKAS菌剂(D4.5)、6 kg·hm-2DNKAS菌剂(D6)、9 kg·hm-2DNKAS菌剂(D9)、12 kg·hm-2DNKAS菌剂(D12)、7.5 kg·hm-2黄腐酸钾(FA-K)、4.5 kg·hm-2DNKAS菌剂+7.5 kg·hm-2黄腐酸钾(D4.5+ FA-K) 共8个处理，每个处理3次重复，共计27个小区，各小区随机区组排列。每小区长70 m，宽1.5 m，面积 105 m2。各药剂分4次随水滴灌，时间分别为5月6日(番茄移栽时)、5月27日、6月7日、6月27日。待番茄生长中期分枝列当出土后，每小区全部采样，调查分枝列当发生情况，计算寄生强度和防效。8月12日采收时，每小区取4.5 m2测产。

寄生数 = 鲜活分枝列当数+枯死分枝列当数

寄生强度 = 分枝列当总株数 / 被寄生的寄主株数

防治效果 =(对照寄生度-处理寄生度)/对照寄生度×100%

选择色泽均匀、大小均一、成熟度一致的番茄红色果实，每小区随机取15个，每个果实纵切成4等份，各取其中的1/4放入捣碎机，以12 000 r·min-1转速1 min匀浆，用于测定相关指标。可溶性固形物含量采用折射仪法[17]测定；可滴定酸含量采用NaOH滴定法[18]测定；a/b色差值采用番茄红素色差仪[19]测定；粘度采用旋转粘度测定法[20]；pH采用pH计测定；霉菌数采用稀释平板涂布法[21]测定。

1.4.3土壤微生物群落碳源代谢利用测定 根际土壤微生物采用Biolog-ECO微平板方法[22]进行，并适当调整。选取防效效果好的D9、D12、FA-K、D4.5+FA-K及CK处理，分别称取各类土样5 g，加入到装有50 mL灭菌的无菌水中，置于28 ℃摇床上180 r·min-1振荡30 min，使土壤充分混匀后静置15 min，采用梯度稀释法将土壤悬液稀释至1 000倍。取上述土壤稀释液150 μL接种到生态板中，并将接种好的Biolog-ECO板放置于28 ℃恒温培养，分别在培养24、48、72、96、120、144、168 h时，用Biolog鉴定系统测定590 nm波长下的吸光度，将测得数据进行每孔平均颜色变化率(average well color development, AWCD)分析。

AWCD=∑(Ci-R)/31

式中，Ci是每个孔的吸光度，R是板内控制孔的吸光度。

选择Biolog-Eco微平板培养120 h的D9、D12、FA-K、D4.5+FA-K及CK处理的培养土壤悬液，进行6大类碳源利用情况分析；同时对土壤微生物检测结果进行微生物群落功能多样性分析，用Simpson指数、Shannon指数和McIntosh 指数来表征。

1.5 数据处理

数据预处理利用Microsoft Excel 2016，方差分析采用SPSS 19.0软件，采用单因素方差分析 (One-Way ANOVA)、Duncan法和Bonferroni法进行多重比较分析。主成分分析、多样性指数分析采用DPS v9.50软件。

2 结果与分析

2.1 不同处理对分枝列当芽管生长的影响

由表1可以看出，无细胞发酵滤液(CF)、菌体甲醇提取液(BM)和菌体水提取液(BW)处理的分枝列当芽长均随稀释倍数的的升高而变长，同一种处理液的原液、10倍、100倍和1 000倍处理间均差异显著。在稀释倍数为1×、10×和100×时，CF、BM、BW三种处理溶液间均表现为BW和BM的分枝列当芽长显著高于CF，表明CF的分枝列当芽长抑制效果优于BW和BM，稀释倍数为1×、10×、100×的无细胞发酵液的分枝列当芽长抑制率分别为100%、83.85%和52.02%；稀释倍数为1×、10×、100×的甲醇提取液的分枝列当芽长抑制率分别为83.07%、51.93%和34.19%；稀释倍数为1×、10×和100×的水提取液的分枝列当芽长抑制率分别为72.40%、50.87%和27.81%；在稀释倍数为1 000×时，CF、BM、BW三种处理溶液的分枝列当芽长无显著差异，且与GR24处理间无差异显著，即1 000×的CF、BM和BW处理对于分枝列当芽长无抑制作用。结果表明，枯草芽孢杆菌DNKAS可以抑制分枝列当芽管生长，其中，无细胞发酵液抑制效果最好，甲醇提取液次之，水提取液最弱。进一步证明，生防菌DNKAS对分枝列当抑制效果最佳的物质可能为细胞次生代谢产物，其次是胞内脂溶性物质，胞内水溶性物质抑制效果最差。

表1 不同处理的分枝列当芽长Table 1 Length of Orobanche aegyptiaca germ tube in different treatments (μm)

2.2 不同处理的小区防治效果

分枝列当的小区防治效果结果(表2)显示，各处理均能显著降低分枝列当的寄生数和寄生度，均具有良好的防治效果。其中，D12、D9、D6、D4.5、FA-K和D4.5+FA-K处理的防治效果分别为52.33%、47.89%、35.66%、28.03%、41.44%和47.22%，分枝列当寄生数分别降低52.36%、47.92%、35.65%、24.05%、41.44%、47.24%，寄生度分别降低52.20%、47.79%、35.66%、28.30%、41.17%、47.42%；6个处理间无显著差异。D3的防治效果为24.09%，寄生数与CK相比无显著差异，但寄生度较CK显著降低了24.26%。可见，随着菌剂剂量的加大，分枝列当寄生数量和寄生度均有明显下降，防治效果有所提高。与FA-K相比，D4.5+FA-K的防治效果提高了14%，而寄生数和寄生度降低约10%，但是无显著差异。与D4.5相比，D4.5+FA-K的防治效果显著提高48.98%，寄生数和寄生度分别降低26.51%和26.67%，但是无显著差异。

表2 不同处理的分枝列当防治效果Table 2 Control effectes of Orobanche aegyptiaca in field experiment of different treatments

2.3 不同处理对小区产量的影响

不同处理的小区产量结果(图1)表明，各处理的加工番茄小区产量均显著高于CK处理，均具有增产效果。其中，D4.5+FA-K处理的产量最高，为136 665 kg·hm-2，显著高于D3、D4.5、D6、FA-K和CK处理，但是与D9、D12没有显著差异。D4.5+FA-K、D9和D12三个处理的产量较CK分别增加60.25%、56.48%和43.52%。纯菌剂处理中，D12的产量最高，为133 445 kg·hm-2，与D9和D6间无显著差异。D4.5、D3和FA-K处理的产量虽在几个处理中最低，但是仍显著高于CK处理，分别比CK显著增加31.89%、22.96%和17.68%，可见，番茄产量与菌剂施用量存在一定的正相关关系。D4.5+FA-K与 FA-K相比显著增产17.26%，与D4.5相比，产量显著提高21.51%，表明黄腐酸钾和菌剂混合施用，比单一施用黄腐酸钾效果更好。

注：不同小写字母表示不同处理间差异在P<0.05水平具有统计学意义。Note: Different lowercase letters indicate statistically significant differences between different treatments at P<0.05 level.图1 不同处理的小区产量Fig.1 Yield of plot in different treatments

2.4 不同处理对加工番茄果实品质的影响

番茄果实的品质性状检测结果(表3)显示，各处理中，可溶固形物含量在4.5～5.0之间，粘稠度小于15，pH均在4.6以下，霉菌数为2，色差均大于2.0，符合国家标准[23]。表明添加菌剂和黄腐酸均未对果品产生不良影响。

表3 不同处理的番茄品质Table 3 Tomato quality indexes of processing tomato in different treatments

2.5 不同处理的根际土壤微生物功能多样性

2.5.1根际土壤微生物群落的AWCD值

AWCD值越高，说明土壤微生物群落的代谢活性越旺盛。不同时间不同处理的AWCD值结果见图2，可见，5个处理的AWCD值整体随时间推移的变化趋势一致，在培养24～120 h时，呈升高趋势，120 h时达到峰值，表明此阶段的土壤微生物数处于对数期，活性增加较快，利用碳源能力强；培养120 h之后，AWCD值逐渐下降，说明各个处理的微生物生长进入对数生长中后期，并且D9、D12、FA-K和D4.5+FA-K处理的微生物数量均高于CK处理。不同处理的AWCD值存在一定差别。从0～168 h的AWCD值来看，土壤微生物群落代谢活性在120 h最高。与CK相比，D4.5+FA-K、FA-K、D12和D9处理的微生物活性依次增加了18.6%、10.2%、8.8%和3.4%。

图2 不同处理的根际土壤微生物群落的AWCDFig.2 Microbial community AWCD of rhizosphere soil in different treatments

2.5.2根际微生物群落的碳源利用 根据不同处理AWCD值的变化情况，选择120 h的根际土壤进行6类碳源的微生物利用分析，结果(图3)显示，D12处理的胺类、酚酸类、氨基酸和碳水化合物类利用情况高于D9，然而两处理只有氨基酸利用情况低于CK。D12多聚物和羧酸类利用情况低于D9，但唯独D12处理的羧酸类利用情况低于CK。D4.5+FA-K处理的6类碳源利用率均明显高于FA-K，且D4.5+FA-K和FA-K处理的胺类、酚酸类、多聚物类和碳水化合物类利用情况均高于CK。D4.5+FA-K处理的羧酸类和氨基酸利用情况高于CK，但FA-K处理的羧酸类和氨基酸利用情况低于CK。

图3 不同处理的根际土壤微生物群落对6类碳源的利用占比Fig.3 Utilization percentage of 6 types carbon sources by microbial communities of rhizosphere soil in different treatments

2.5.3根际微生物群落的微生物多样性指数

优势度指数、均匀度指数和丰富度指数是常用的群落多样性分析指标。优势度指数反映各物种的种群数量变化情况，指数越大，说明群落内物种数量分布越不均匀，优势种的地位越突出。丰富度指数用于表征微生物群落的种类多样性。均匀度指数用以反映土壤利用碳源种类和程度差异，均匀度越大表明微生物种群对碳源利用差异越大。对培养120 h的D9、D12、FA-K、D4.5+FA-K及CK处理的AWCD值，进行微生物多样性分析，结果(表4)显示，D12、FA-K和D4.5+FA-K处理的丰富度指数较高，显著高于CK处理，但3个处理间无显著差异。D9的丰富度指数与CK间无显著差异，D4.5+FA-K的丰富度指数与FA-K无显著差异。不同处理间的优势度指数和均匀度指数均无显著差异。结果表明，DNKAS菌剂和黄腐酸钾均可增加根际土壤的微生物种类，但是对于建立菌群优势地位和碳源的利用程度没有影响。

表4 不同处理根际土壤的微生物多样性指数Table 4 Microbial community diversity indexes in different treatmments

3 讨论

目前，对于列当的微生物防治主要运用列当病原菌，能取得良好的防治效果。王亚娇等[24]从感病的列当中分离出尖孢镰刀菌Br-2，大田试验显示对弯管列当防治率高达58.27%。吴元华等[25]将自主分离纯化得到的生防镰刀菌用于烟田列当防治试验，发现不仅可以推迟列当出土时间，还能达到62.44%的防治率。对土传病害拮抗菌进行列当防治的研究较少。枯草芽孢杆菌对环境有较强的适应性，具有可在植物或土壤上大量繁殖和定植、竞争营养位点和空间位点、诱导抗性、促生和增产等特性，广泛用于植物病害防治[26]，拥有作为列当生防菌的潜力。阻止列当芽管伸长，是列当防治的主要方式之一。本研究表明，枯草芽孢杆菌DNKAS的无细胞发酵液、菌体甲醇提取液、菌体水提取液对分枝列当的芽管生长具有显著抑制作用。Barghouthi和Salman[27]研究发现，枯草芽胞杆菌QUBC16的无细胞发酵液可有效减少分枝列当芽管长度，与本研究结果一致。本研究中，无细胞发酵液对芽管生长抑制效果最佳，说明细胞次生代谢产物中有效物质起主要作用。然而是何种物质，还需进一步探究。

列当的寄生数量和寄主作物产量是评判生防菌防治效果的关键指标。已有研究表明，密旋链霉菌[12]和灰黄青霉[28]均可减少分枝列当萌发率，使列当寄生数下降，寄主作物产量增加。田间小区试验表明，枯草芽孢杆菌DNKAS通过降低分枝列当寄生数量，使加工番茄增产。结合皿内试验和田间小区研究发现，枯草芽孢杆菌DNKAS通过抑制分枝列当芽管生长，减少芽管与加工番茄根部接触的概率，进而降低分枝列当出土数量，提高防治效果, 减轻分枝列当对加工番茄寄生的影响，使加工番茄增产。原因除了枯草芽孢杆菌可以减轻分枝列当的危害，还可能与枯草芽孢杆菌具有抗病、促生作用有关。基于田间小区试验结果，枯草芽孢杆菌DNKAS的单次施用量低于4.5 kg·hm-2，不能形成优势菌群，而高于12 kg·hm-2，菌剂成本太高，综合考虑认为，合理的使用剂量为9～12 kg·hm-2。为降低人工成本和时间成本，建议用随水滴灌药剂进行防治。

Biolog-ECO微平板法是研究微生物对生态环境影响的重要方式。研究[29]发现，枯草芽孢杆菌Bs-15可使板栗土壤中微生物活性增加，显著提高优势度指数、均匀度指数和丰富度指数。本研究的Biolog-ECO微平板试验发现，枯草芽孢杆菌DNKAS和黄腐酸钾均可增加土壤微生物活性、碳源总利用率、微生物数量和种类；同时，枯草芽孢杆菌DNKAS和黄腐酸钾枯草芽孢杆菌DNKAS的微生物丰富度指数高于CK，而优势度指数和均匀度指数与CK无显著差异。表明枯草芽孢杆菌DNKAS和黄腐酸钾均具有调整土壤微生物群落结构，使土壤中微生态功能更加趋于稳定的功能[29-30]。

目前，黄腐酸钾在国内主要用于作物增产、提升品质和改良土壤，本研究发现黄腐酸钾可用于列当的防治。研究表明，黄腐酸钾具有促生、抗病、抗旱、提高过氧化物酶酶活等作用[31]，而根部土壤微生物群落结构的改变和过氧化物酶活性的升高，对列当寄生和生长有抑制作用[32]。因此，黄腐酸钾可以减少分枝列当的寄生发生，促进加工番茄增产。