表达Cry1Ab和Cry2Ab蛋白的转基因玉米GAB-3对四种主要鳞翅目害虫的抗性评价

徐晓丽,姜媛媛,王鹏飞,来勇敏,陈笑芸,徐俊锋*

(1.浙江省农业科学院农产品质量安全与营养研究所, 杭州 310021;2.浙江大学农业与生物技术学院, 杭州 310012)

玉米是全球主要种植作物之一，也是我国重要的粮食作物和饲料作物，对稳定农业产业结构和食品安全有重要作用。在我国，玉米在生育期极易受黏虫Mythimnaseparata(Walker)、亚洲玉米螟Ostriniafurnacalis(Guenée)、棉铃虫Helicoverpaarmigera(Hübner)等鳞翅目害虫的为害，严重时会导致减产甚至绝收[1-2]。亚洲玉米螟属于鳞翅目草螟科，是我国玉米生产上为害较严重的害虫，幼虫为害玉米未展开的幼嫩心叶，大龄幼虫蛀茎，阻断营养运输，还直接蛀食玉米雌穗，造成霉变，严重影响玉米产量和品质[3-4]。黏虫和棉铃虫属于鳞翅目夜蛾科，黏虫取食玉米叶片，形成缺刻，严重时可造成绝收，近几年黏虫在局部爆发成灾，严重发生的局面常有发生；黄淮海地区由于棉花种植面积降低，棉铃虫对玉米为害加重[5]。除上述几种常见害虫外，2019年草地贪夜蛾Spodopterafrugiperda(J. E. Smith)成为威胁我国玉米产业的又一重要害虫。草地贪夜蛾源于美洲热带和亚热带地区，属鳞翅目夜蛾科，是世界范围内严重威胁粮食安全的重大灾害生物，2019年侵入我国，并快速扩散[6]，对我国农业生产造成严重危害[7]。

长期以来，化学农药是防治害虫的主要方法，不仅污染生态环境，同时易杀伤非靶标生物，不利于有害生物的综合治理[8]，由于长期单一用药产生的抗药性导致化学防治效果不断降低。转基因抗虫玉米的商业化种植为防治害虫提供了新途径，并逐渐成为一些国家防控害虫的主要的手段。杀虫晶体(insecticidal crystal，Cry)蛋白是应用广泛的杀虫蛋白，其中在玉米上应用的抗鳞翅目害虫的Cry蛋白主要包括Cry1和Cry2，Cry1包括Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1C、Cry1F、Cry1A.105等，Cry2主要是Cry2Ab[9]。转基因抗虫玉米的种植大大减少了化学农药的使用，提高了玉米产量，但是20多年来持续地种植转基因抗虫植物也导致一些国家和地区抗性害虫的出现[10-12]，为延缓害虫抗性的产生，目前采取的策略是高剂量和庇护所，以及同时表达2种以上不同类型的杀虫蛋白，前者是通过采用提高杀虫蛋白的表达水平以及按比例在转基因作物周围种植非转基因作物，使敏感个体和抗性个体交配，达到稀释抗性基因的目的；后者通过杂交或多基因同时转化在转基因植物中同时表达2个及以上不同类型的杀虫基因，既扩大了杀虫谱，又能延缓害虫抗性的产生[13-14]。

目前，我国已研发获得多个转基因玉米新品系进入不同阶段试验[15]。转cry1Ab和cry2Ab基因抗虫玉米GAB-3是浙江大学研发的转基因抗虫玉米新品系[16]。Cry1Ab和Cry2Ab蛋白在昆虫中肠上的作用位点不同，有研究发现Cry1Ab和Cry2Ab在草地贪夜蛾中肠刷状缘膜囊泡(BBMV)上的结合位点不同，并且二者在控制害虫上具有协同作用[17]，因此，同时表达这两种杀虫蛋白能够起到扩大杀虫谱和延缓害虫抗性发生的作用。本研究旨在通过田间接虫和室内生测的方法，研究评价转基因玉米GAB-3对玉米生产上4种主要的鳞翅目害虫的抗性。

1 材料与方法

1.1 供试玉米材料

转基因玉米GAB-3表达Cry1Ab和Cry2Ab抗虫蛋白，同时以G10evo-EPSPS基因作为筛选标记，供试用的转基因玉米材料及其非转基因亲本对照种子瑞丰1号均由浙江大学沈志成提供，田间抗虫性测试中除了非转基因亲本对照，还增加了浙江当地对照玉米品种浚单58，种子购自市场。

1.2 供试虫源及培养条件

供试黏虫、亚洲玉米螟、棉铃虫和草地贪夜蛾虫卵购自北京延美生物科技有限公司，在人工气候培养箱(BIC-250，上海博迅)孵化，温度(27±1)℃，湿度(90%±5%)，光周期16 h光照/8 h黑。

1.3 玉米组织Cry1Ab和Cry2Ab蛋白表达量测定

采用ELISA方法检测转基因玉米各组织中杀虫蛋白含量。在玉米心叶期(V7～V8)取植株幼嫩心叶，抽雄期取未散粉雄穗，吐丝期取花丝、苞叶、穗尖、穗轴，灌浆期取幼嫩籽粒，每种组织设10个生物学重复，每个生物学重复设3次技术重复。取30 mg不同玉米组织加入1 mL提取液，迅速研磨成浆，静置2 h，离心后取上清。采用Cry1Ab/Cry1Ac和Cry2A检测试剂盒(美国ENVIROLOGIX公司)检测并绘制标准曲线。采用680酶标仪(美国伯乐)450 nm下测定吸光值。

1.4 室内抗虫性测定

对黏虫的抗性测定选取V6～V7期玉米相同部位叶片；对亚洲玉米螟和棉铃虫的抗性测定分别选取V7～V8期玉米幼嫩心叶、抽雄期尚未抽出的雄穗、吐丝期玉米的幼嫩花丝、苞叶、穗尖、穗轴及灌浆期玉米幼嫩籽粒；对草地贪夜蛾的抗性测定选取V6～V8期玉米相同部位叶片。黏虫和亚洲玉米螟的生测以20头初孵幼虫为1个处理，设5次重复；为防止试虫密度大导致自残，棉铃虫和草地贪夜蛾采用5头初孵幼虫为1个处理，设20次重复。培养皿用封口膜封闭防止幼虫钻出，然后放置于培养箱中培养。每天固定时间检查幼虫存活情况并记录活虫数，同时更换相同来源的玉米组织，毛笔轻触幼虫不能爬行则视为死亡。当转基因玉米组幼虫存活率为0时，试验结束。草地贪夜蛾生长至2龄后时容易出现自残现象，测试时间为4 d。

1.5 田间抗虫性测定

随机区组设计，每品种设三次重复，小区面积为30 m2(5 m×6 m)，行距60 cm，株距25 cm，并在试验小区设置隔离带。常规播种方式和栽培管理，全生育期不喷洒杀虫剂。

1.5.1心叶期黏虫抗虫性评价 玉米心叶期(V6～V7)，用毛笔将黏虫初孵幼虫轻刷到玉米心叶，每小区接虫40株，每株玉米接虫40～60头。接虫14 d后逐株调查玉米叶片被害程度，分级标准及抗性评价标准参照农业部 953 号公告[18]。

1.5.2心叶期亚洲玉米螟抗虫性评价 玉米心叶期(V7～V8)，用毛笔将亚洲玉米螟初孵幼虫轻刷到玉米心叶，每小区接虫40株，每株玉米心叶接虫40～60头。接虫14 d后逐株调查玉米植株中上部位被亚洲玉米螟为害情况，分级标准及抗性评价标准参照玉米抗玉米螟鉴定技术规范[19]。

1.5.3吐丝期亚洲玉米螟抗虫性评价 玉米吐丝期(全田60%以上的植株雌穗花丝露出苞叶)，用毛笔将亚洲玉米螟初孵幼虫轻刷到花丝，每小区接虫40株，每株玉米花丝接虫40～60头，接虫14 d后调查玉米雌穗被害情况(包括花丝和穗尖被害情况、存活幼虫数量和龄期及蛀孔隧道长度)，同时剖秆调查茎秆受害情况。雌穗被害级别分级标准及抗性评价标准参考农业部 953 号公告[18]。

1.6 数据处理

采用SPSS 20.0系统对所有数据进行方差分析，采用Duncan新复极差法对玉米组织ELISA检测结果和田间抗虫性数据进行多重比较分析，室内抗虫性数据进行单因素方差分析，百分数进行反正弦转换，采用LSD进行两两比较。

2 结果与分析

2.1 GAB-3不同组织Cry1Ab和Cry2Ab蛋白含量

GAB-3不同组织中Cry1Ab和Cry2Ab蛋白含量见表1。ELISA检测结果显示，GAB-3不同组织中Cry1Ab含量为2.70～28.49 μg·g-1，心叶期叶片中Cry1Ab含量最高，达28.49 μg·g-1，接下来依次是灌浆期籽粒、雄穗、穗尖、穗轴、苞叶和花丝，不同组织Cry1Ab蛋白含量有显著性差异(ANOVA:F=197.928;df=6;P<0.05)；GAB-3

表1 转基因玉米GAB-3不同发育阶段各组织中Cry1Ab和Cry2Ab蛋白含量Table 1 Content of Cry1Ab and Cry2Ab in transgenic maize GAB-3 tissues at different growth stages (μg·g-1 FW)

不同组织Cry2Ab含量为0.98～9.26 μg·g-1，雄穗中Cry2Ab含量最高为9.26 μg·g-1，接下来依次是穗尖、心叶期叶片、苞叶、穗轴、灌浆期籽粒和花丝，不同组织Cry2Ab含量有显著性差异(ANOVA:F=139.962;df=6;P<0.05)。

2.2 GAB-3对4种鳞翅目害虫的室内杀虫效果

GAB-3不同生育期不同组织对4种鳞翅目害虫的生测结果如表2所示。

表2 4种害虫初孵幼虫取食GAB-3和其非转基因对照各组织后的存活率Table 2 Survival of neonate larvae of of feeding on different tissues of GAB-3 and its control

GAB-3心叶对黏虫有很强的抗性，初孵幼虫取食GAB-3叶片4 d后存活率为0，而非转基因对照组黏虫存活率为100%。

GAB-3心叶、雄穗、花丝、苞叶、穗尖、穗轴和籽粒等组织对亚洲玉米螟有很强的毒杀作用，各组织处理组的亚洲玉米螟初孵幼虫在测试2～3 d内全部死亡；而非转基因对照玉米处理组亚洲玉米螟存活率为89.00%～99.00%。

GAB-3心叶、雄穗、花丝、穗尖、籽粒等组织对棉铃虫有很强的抗性，取食GAB-3各组织的棉铃虫初孵幼虫在测试2～5 d内全部死亡；而非转基因对照玉米处理组棉铃虫存活率为80.00%～96.00%。

GAB-3心叶对草地贪夜蛾初孵幼虫有很强的抗性，测试4 d后，幼虫存活率为11.00%，存活的草地贪夜蛾也停止生长发育，处于1龄的状态，而非转基因对照组幼虫已进入3龄，存活率为81.00%(图1)。

A：取食GAB-3的幼虫；B：取食非转基因对照的幼虫。A: Larva feeding on GAB-3 maize; B: Larva feeding on non-transgenic control maize.图1 测试5 d后存活的草地贪夜蛾幼虫 Fig.1 Larvae of Spodoptera frugiperda feeding on GAB-3 or non-transgenic control maize for 5 d

2.3 GAB-3对亚洲玉米螟和黏虫的田间抗性

2.3.1心叶期GAB-3田间抗虫性 田间接虫14 d后调查结果显示：转基因玉米GAB-3接黏虫和亚洲玉米螟后未观察到任何为害症状，抗性等级为高抗；非转基因对照和当地对照玉米为害较重，黏虫的食叶级别达到2.78和3.71，抗性级别为抗虫，亚洲玉米螟的食叶级别达到6.64和6.46，抗性水平为感虫(表3)。表明心叶期转基因玉米GAB-3对黏虫和亚洲玉米螟有良好的抗虫效果。

表3 心叶期GAB-3对黏虫和亚洲玉米螟田间抗性Table 3 Resistance of GAB-3 to larvae of Mythimna seperata and Ostrinia nubilalis at whorl stage under artificial infestations in field

2.3.2吐丝期GAB-3田间抗虫性 吐丝期玉米接亚洲玉米螟14 d后调查植株雌穗受害情况。调查结果表明，转基因玉米GAB-3被害级别为1.06，抗性类型为高抗；其对应的非转基因对照玉米和当地对照玉米被害级别为5.86和6.19，抗性类型均为感虫(表4)。转基因玉米单株蛀孔数、隧道长度及亚洲玉米螟活虫数均为0，而非转基因对照调查获得单株活虫数达到1.28头，蛀孔数为1.02个，几乎每一株都有被害。

表4 吐丝期GAB-3雌穗对亚洲玉米螟的田间抗性Table 4 Resistance of GAB-3 to larvae of Ostrinia nubilalis at silking stage under artificial field infestations

剖秆调查结果表明，转基因玉米GAB-3茎秆无被害，而非转基因对照玉米和当地对照玉米茎秆受害严重，非转基因对照单株蛀孔数为0.71个，单株活虫数为0.3个，单株隧道长度达1.39 cm；当地对照玉米单株蛀孔数达1.15个，单株活虫数达0.45，单株隧道长度为1.36 cm(表5)。

表5 玉米茎秆受害情况Table 5 Maize stalk-damage level by lepidopteran pests under field conditions

综合雌穗受害情况和茎秆受害情况，转基因玉米GAB-3抗性显著高于非转基因对照玉米，在吐丝期对亚洲玉米螟具有良好抗虫效果。

3 讨论

Cry1和Cry2类Bt蛋白是转基因抗虫玉米中应用最广泛的杀虫蛋白，Cry1类对鳞翅目害虫有杀虫活性，Cry2类对鳞翅目和双翅目昆虫有杀虫活性。Cry1类Bt蛋白中应用较多的有Cry1Ab和Cry1Ac，其中Cry1Ab在转基因玉米中的推广应用面积最大，比如Bt11、Bt176、MON810及其衍生品系等。Cry2Ab在杀虫谱上与Cry1类杀虫蛋白有所不同，并且在鳞翅目害虫中肠刷状缘膜囊泡(BBMV)上的结合位点不同[20]，因此，Cry2Ab常与Cry1类杀虫蛋白组合使用，如MON89034同时表达Cry2Ab2和Cry1A.105，从而达到延缓害虫抗性发展的目的。

在我国，第一代亚洲玉米螟的发生通常在春玉米心叶期，幼虫主要取食幼嫩的心叶，叶片展开后会形成排孔，第二代玉米螟为害春玉米雄穗、花丝、穗轴和穗尖。在心叶期玉米田间抗虫性试验中，自然发生和人工接的亚洲玉米螟共同为害，导致非转基因对照和当地对照玉米由于亚洲玉米螟取食造成的平均食叶级别达到6以上，而GAB-3未观测到任何被害状；在田间进行人工接黏虫试验中，接虫3 d后在非转基因玉米上观察到黏虫取食较多，但由于接虫时期多雨，黏虫未发育至暴食期大多已死亡，接虫2周后调查显示非转基因玉米的为害并不严重，食叶级别为2.78和3.71，但依然高于转基因玉米GAB-3(食叶级别为1)，显示心叶期转基因玉米GAB-3对黏虫也有很高的抗性。

亚洲玉米螟除了取食玉米心叶，对玉米全株都可造成为害，吐丝期玉米田间接虫试验显示GAB-3雌穗没有明显为害状，未检测到活虫和蛀孔，而非转基因对照玉米和当地对照玉米受害很严重，几乎每一株都有被害。田间对玉米雌穗的调查发现，穗上的害虫除了亚洲玉米螟外，桃蛀螟Conogethespunctiferalis的为害也非常严重。近年来，桃蛀螟在玉米上的为害逐年上升，已经成为夏玉米区穗期主要害虫[4-5,21-22]。本研究中与非转基因玉米上自然发生的桃蛀螟造成的严重为害相比，转基因玉米GAB-3上几乎没有发生桃蛀螟的为害，这表明GAB-3也对桃蛀螟有很高的抗性。在穗期同时进行了剖秆调查，为害非转基因玉米茎秆的害虫主要有亚洲玉米螟和桃蛀螟，而GAB-3也没有发生任何为害，显示GAB-3全株对亚洲玉米螟和桃蛀螟都具有很高的抗性。

草地贪夜蛾侵入我国后，成为我国的又一玉米重大害虫[7,23]，并且该害虫对多种转基因作物和农药产生较强抗性，李国平等[24]研究显示,入侵我国的草地贪夜蛾对Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1F、Cry2Ab和Vip3A五种Bt蛋白未产生抗性，GAB-3对草地贪夜蛾的生测结果显示取食GAB-3心叶的幼虫死亡率显著高于非转基因对照组，并且存活的幼虫停止生长发育，表明GAB-3在抗草地贪夜蛾上具有良好的应用前景。

随着我国玉米种植面积的增加，玉米病虫害发生一直呈加重趋势，传统化学农药的应用带来环境污染、抗性产生等等方面的问题。自1996年以来，国际上转基因玉米的种植面积逐年增长，带来了巨大的经济和环境效益。我国于2020年1月21日发布2019年农业转基因生物安全证书(生产应用) 批准清单，其中包括2个转基因抗虫玉米品种[25]，意味着我国在转基因玉米商业化进程上迈出了重要一步。在转基因玉米的研发上，我国各科研院所及企业一直在进行不懈的努力，目前已研制出多种具有良好抗性的转基因玉米新品系。本研究表明，转基因玉米GAB-3对玉米上五种鳞翅目害虫具有很强的抗性，具有良好的生产应用前景。