禽疱疹病毒活载体疫苗研究进展

王梦阁, 吴英, 程安春, 汪铭书, 朱德康, 贾仁勇, 刘马峰,陈舜, 赵新新, 杨乔, 张沙秋, 黄娟, 刘韵雅, 张玲, 于艳玲

(四川农业大学动物医学院禽病防治研究中心, 预防兽医研究所, 动物疫病与人类健康四川省重点实验室, 成都 611130)

家禽生产是畜牧业中增长最快的产业之一，每十年以25%的速度增长。禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)、新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)、马立克氏病毒(Marek’s diseas virus，MDV)、传染性喉气管炎病毒(nfectious laryngotracheitis virus，ILTV)、传染性法氏囊病毒(infectious bursal disease virus, IBDV)、鸭肠炎病毒(duck enteritis virus，DEV)、鸭甲肝病毒(duck hepatitis A virus，DHAV)、鸭黄病毒(duck flavivirus)等，是目前危害养禽业的几种常见病毒病，感染后的肉蛋禽死亡率高、饲料报酬增高，种禽产蛋下降等现象在临床上屡见不鲜。对于这些病毒性疾病而言，往往无特效治疗药物，一旦发病后的治疗效果都不甚理想，其防控主要依赖于疫苗接种。目前针对上述禽病毒性疾病的主要疫苗种类包括灭活疫苗和弱毒活疫苗。灭活疫苗使用安全，不会造成病毒的扩散，耗时少，但免疫效果往往不够理想且需要多次免疫才能有较好效果，此外还必需添加佐剂，成本较高。弱毒疫苗比灭活苗产生免疫力快，但存在病毒毒力返强的潜在风险[1]。相比而言，随着基因工程技术的发展，能够同时表达多种外源基因的新型病毒活载体疫苗逐渐成为当前疫苗开发的主要方向。

新型病毒活载体疫苗是用基因工程技术将病毒 (常为疫苗弱毒株)构建成一个载体(或称外源基因携带者)，把外源基因(包括重组多肽、肽链抗原位点等)插入其中使之表达的活疫苗[2]。该类疫苗通过向宿主免疫系统提交免疫原性蛋白的方式免疫动物，与自然感染时的真实情况很接近，可诱导产生的免疫比较广泛，包括体液免疫和细胞免疫，甚至黏膜免疫[3]，同时具备活疫苗的免疫效力高、成本低及灭活疫苗的安全性好等优点。且多个外源基因同时表达，可以达到一针防多病的目的，不仅节约了大量的人力物力，减轻了动物的应激反应，而且能够很好地解决临床上多种病毒性疾病混合感染和抗原变异导致单一疫苗免疫失败的情况，显示出良好的应用前景。

1 病毒活载体疫苗概述

疫苗的研发是一个复杂而系统的工程，一支疫苗从研发到上市至少需要8～20年的时间。现在疫苗的类型主要包括传统疫苗和新型疫苗。新型疫苗包括亚单位疫苗、基因工程苗、抗独特型抗体、合成肽苗等，活载体疫苗是近几年来发展起来的新型基因工程疫苗，主要应用于动物细菌和病毒性传染病疫苗的改造和多价疫苗研制，以预防抗原变异和混合感染的发生。目前，腺病毒活载体疫苗应用最广泛，已被应用于呈递外源基因并在细胞中大量表达外源基因，刺激机体产生广泛的体液免疫和细胞免疫。除腺病毒之外，痘病毒也是疫苗平台开发中常用的载体疫苗之一，这在很大程度上归功于广泛而成功的天花疫苗(和相关改良的安卡拉痘苗)的开发和使用，从而为人类提供了对于痘病毒特性和安全的认识，包括：插入外源基因的大基因容量、病毒对哺乳动物细胞的广泛趋向性、抗原的短时间生产和病毒在细胞质中的定位。杆状病毒是表达外源蛋白的有效工具，可以表达高质量的重组蛋白。同时携带哺乳动物细胞活性启动子的杆状病毒，能够在各种哺乳动物中转移和表达外源基因。

经济、方便在疫苗研发中也同样重要。新城疫病毒基因组小，易于操作，含有可修饰的模块化基因组，可以适应外源的遗传信息；新城疫重组病毒遗传性质稳定，可通过饮水、滴鼻、气雾进行免疫。伪狂犬病毒属于疱疹病毒科(Herpesviridae)，感染性良好，具有大量的非必需基因，可以插入外源基因，同样具有作为载体疫苗的优势；伪狂犬病疫苗具有良好的抗原性，缺失非必需基因后插入外源基因构建的重组病毒，可以作为两种甚至多种疫病的标记疫苗。狂犬病病毒和水泡性口炎病毒属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)，他们的基因组遗传性稳定，易于遗传操作。由于弹状病毒科病毒基因组整合到宿主基因组中不会发生重组、逆转，因此许多外源基因已被插入基于弹状病毒的载体并成功表达。

2 禽疱疹病毒载体疫苗预防禽病毒性疾病的优势与缺陷

在过去的研究中，猫疱疹病毒(feline herpes virus，FHV)、新城疫病毒、传染性喉气管炎病毒、鸭肠炎病毒、马立克氏病病毒、火鸡疱疹病毒(turkey herpes virus，HVT)、痘病毒(pox virus)、腺病毒(adenovirus)、脊髓灰质炎病毒(poliovirus)、流感病毒(influenza virus)等都曾被用于作为载体开发预防禽病毒性疾病的爆发。相比之下，以鸡马立克氏病毒、传染性喉气管炎病毒和鸭肠炎病毒为代表的禽疱疹病毒，在作为抵抗禽病毒性疾病疫苗的载体开发方面具有诸多优势。疱疹病毒家族成员的基因组庞大，约150 kb左右，预计有约70～80个编码基因，其中至少有20%的基因是非必需的，可容纳多个外源基因的同时插入，且其宿主谱窄，免疫动物后不容易产生流行病学方面的不良后果。同时因其病毒表面具有囊膜，作为载体容易表达表面糖蛋白，诱发体液免疫和细胞免疫。由于许多疱疹病毒经粘膜途径感染，构建的载体活疫苗也可经黏膜途径递呈抗原，诱导特异性黏膜免疫[4]。与传统疫苗相比，禽疱疹病毒活载体疫苗具有以下优点：第一、生产成本低，可廉价、大批地生产；第二、易于区分感染动物和免疫动物[5]，由于活载体疫苗中只含有外源抗原的蛋白成份，或者缺失某一蛋白成份，因此可通过检测野毒株和活载体疫苗中是否存在病毒蛋白的抗体，从而区分野毒感染者和免疫动物；第三、利用活载体可制成多价疫苗，达到一针防多病的目的。理论上许多病毒载体的基因组可缺失、插入或直接修饰，但临床应用上遗传性质并不一定稳定，在构建重组病毒疫苗前应评估其潜在风险。尽管火鸡疱疹病毒、鸭肠炎病毒已被大量用于活载体疫苗研究，当动物初次免疫后再免疫时，机体还有可能产生对活载体的免疫排斥[6]、其他类型疫苗对活载体疫苗的影响、疫苗针对靶动物的局限性等多种限制因素。值得注意的是，减毒疱疹病毒疫苗可能重组形成强毒的野毒病毒，毒力返强带来严重后果[7]。

3 禽疱疹病毒活载体疫苗的构建

3.1 重组活载体疫苗基本原理

重组活载体疫苗通常是以动物病原弱毒或无毒株为载体，通过同源重组(homologous recombination，HR)、Fosmid多片段拯救系统、细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome, BAC)、CRISPR/Cas9系统等基因编辑技术操控病毒载体基因组，插入并表达外源抗原基因，但该载体病毒的生存与繁殖不受影响，且能诱导机体的体液免疫和细胞免疫。接种这种重组疫苗以后，不仅能对原病毒产生保护力，还获得对插入基因相关疾病的保护力[8]；同时，一个载体可以表达多个免疫基因，可获得多价苗或多联疫苗。构建重组病毒首先必需进行病毒复制非必需区筛选，将外源基因插入到病毒复制非必需区，才能不影响病毒的复制。有些基因虽然为非编码区，但选择其作为插入位点将影响亲本株的复制能力及重组病毒的免疫效力，因此应严格选择插入位点。其次，应考虑外源基因的表达能力，包括启动子、增强子、起始密码子和终止密码子等因素。为了提高外源基因表达量，一般使用表达能力较强的启动子，如CMV、SV40等。

3.2 禽疱疹病毒载体的构建方法

3.2.1同源重组 基因的同源重组是较普遍的生物学现象，从噬菌体、细菌到真核生物都有存在[9]。Li和Elledge[10]在2005年首次报道了一种快速构建重组DNA分子的体内克隆基因的方法——MAGIC。该方法利用细菌接合转移，将携带目的片段的供体质粒和携带受体质粒的细菌进行交配，在同一个细胞内，供体和受体质粒经核酸内切酶I-SceI各自消化成两个线性化片段，从而进行同源重组。MAGIC法适用于全基因组的同源重组，通过构建含有插入位点左右两侧同源臂的转移载体质粒，将目的序列插入到病毒的基因组中，转移载体包括筛选标记，从而区分野毒株与重组病毒;也同样适用于BAC、CRISPR/Cas9系统构建重组病毒。

3.2.2细菌人工染色体 由于禽疱疹病毒基因组庞大，在其基础上运用传统的同源重组方法进行改造费时费力。近年来随着分子生物学技术的发展，利用BAC技术，通过同源重组将BAC载体功能序列mini-F插入到禽疱疹病毒基因组中的某个位点，用有限稀释和嗜斑纯化的方法将带有筛选标记的重组病毒纯化出来，最后用电转化方法转入E.coli，以获得全基因组感染性克隆[11]。同时可用Red重组在细菌内对感染性克隆进行操控，将改造后的感染性克隆全基因组转染宿主细胞内进行拯救，获得插入外源基因的重组病毒。用BAC法拯救出来的病毒不含有野毒，经过多次传代后也未出现。

3.2.3Fosmid多片段拯救系统 Fosmid载体是含有大肠杆菌 F-因子的粘粒(cosmid)，既具有粘粒载体增殖与包装效率高的优点，又具有大肠杆菌 F-因子单拷贝、稳定性高的特性[12]。构建Fosmid基因文库的方法是通过物理方法随机剪切病毒基因组DNA，经末端补平后与平末端的Fosmid载体连接，构建不具有偏向性的基因组文库，构建好之后可以在大肠杆菌中复制和保存。外源基因在细菌内通过基因编辑技术将基因插到全病毒基因组的Fosmid粘粒，通过提取质粒将病毒拯救从而获得大量重组病毒，这种方法比BAC更稳定、更便利。

3.2.4CRISPR/Cas9系统 常规疫苗一般是通过同源重组或BAC技术产生的，但生产这种疫苗需要重新构建转移载体和多轮蚀斑纯化才能获得重组病毒。CRISPR/Cas系统是一种微生物针对入侵病毒和其他遗传因素的天然免疫机制，Ⅱ型CRISPR/Cas系统常用于真核细胞中的基因编辑。CRISPR/Cas9系统是在Cas9内切酶作用下切割双链DNA进行基因敲入的，且有一段高度同源的DNA修复模板(供体模板)存在时，在生物体内启动同源定向修复路径，将一段外源DNA定点插入基因内部，从而准确有效地进行基因编辑。CRISPR/Cas9系统在高效生产转基因细胞和动物模型方面取得了巨大成功，已被用于操纵几种大型DNA病毒的基因组，包括Ⅰ型单纯疱疹病毒、腺病毒、伪狂犬病病毒、牛痘病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、豚鼠巨细胞病毒和鸭肠炎病毒。

3.3 外源基因在禽疱疹病毒活载体疫苗中的表达及评价

在构建重组病毒活载体疫苗中，外源基因表达能力是研究重组疫苗的一个关键因素。近年来，以火鸡疱疹病毒作为载体成功表达了多种禽病毒保护性抗原基因，包括鸡传染性喉气管炎病毒的gB基因[13]、传染性法氏囊病毒的VP2基因[14]和禽流感病毒的HA基因[15]，以鸡传染性喉气管炎病毒为载体表达禽流感病毒的HA基因[16]，以鸭肠炎病毒为载体表达禽流感病毒HA基因[17-23]，鸡传染性喉气管炎病毒N、S、S1基因[24]，共表达鸭坦布苏病毒PrM基因和高致病性禽流感HA基因[17]，鸭肝炎Ⅰ型和Ⅲ型病毒的VP1基因[25]。同个载体中表达多个外源基因，应优先考虑真核表达载体的选择，有效的转录起始是外源基因能否在宿主细胞中高效表达的关键步骤之一[26]。鸭瘟-鸭肝炎重组病毒的鸭肝炎Ⅰ型和Ⅲ型VP1基因串联表达，是通过在真核表达载体中两个VP1间加入2A切割元件，切割效率达90%，有利于不同血清型VP1抗原的表达。也有学者把Ⅰ型VP1插入鸭瘟病毒基因组并成功表达，但在动物攻毒保护试验中免疫效果不好，可能跟VP1基因插入位点有关。除串联表达之外，也可选同一载体的不同插入位点来表达两个或两个以上的外源基因，鸭坦布苏病毒PrM基因和高致病性禽流感HA基因分别插入鸭瘟病毒基因US7和US8、UL26和UL27之间来实现共表达。为验证外源基因是否能成功表达，需通过体外和体内试验进行检测。体外试验通过免疫印迹、间接免疫荧光试验验证外源蛋白的表达，体内实验可检测攻毒后产生中和抗体水平、细胞免疫、体液免疫、半数致死量等多方面进行评价。体外和体内试验验证外源基因是否成功表达缺一不可，观察活载体疫苗保护率是评估疫苗效果的重要指标。除此之外，评价活载体疫苗对宿主存在潜在的安全性风险，应考虑以下几点因素：第一、选择针对某种或某些病原合适的活载体；第二、外源基因插入载体适当的位置并能够稳定地表达外源抗原并将其呈递到恰当的部位，刺激机体免疫系统产生相应的免疫反应；第三、不同的疫苗免疫策略同样也会影响疫苗的效果与安全性，其免疫日龄、免疫方式、免疫间隔时间、免疫剂量和几种疫苗联合使用是评估疫苗的主要程序。

3.4 禽疱疹病毒重组载体疫苗的筛选与鉴定方法

重组病毒的筛选方法，通常是将β-半乳糖苷酶基因(LacZ)、红色荧光蛋白(red fluorescent protein，RFP)、绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)等报告基因与转移载体融合，筛选出纯化的重组病毒。但真正理想的重组疫苗不应包含标记基因，因此可利用有痕缺失或无痕缺失的方法去掉报告基因。在多轮蚀斑纯化获得重组病毒后，要进行体外生物学试验评估其稳定性，以期获得更加安全、有效的疫苗。

4 禽疱疹病毒载体疫苗的研究进展

4.1 以MDV为载体的重组病毒活疫苗

马立克氏病(MD)是由MDV引起的一种鸡的恶性T淋巴细胞瘤疾病，利用致弱株及天然不致病株可以有效地预防本病[27]。 MDV疫苗病毒有3种血清型：致弱的MDVⅠ型，天然不致病的MDVⅡ型及血清Ⅲ型火鸡疱疹病毒(HVT)[28]。在3种血清型的疫苗株中，血清Ⅰ型已被用来构建重组病毒以预防禽马立克氏病[29]。MDV病毒疫苗目前被认为是用于表达多价重组活疫苗最有效的载体，可以表达其他病毒的抗原来诱导保护性免疫原性，这是因为该疫苗即使在卵内存在母源抗体的情况下也能抵抗致病性MDV毒株。其中HVT是最近发展起来的病毒载体，在全世界已经被用作家禽业对抗马立克氏病的安全有效疫苗。 HVT的优点是对鸡及其它动物均无致病性，使用安全，疫苗接种后受母源抗体水平干扰小，可在鸡体内形成长达数周的病毒血症，且终生潜伏感染。Iqbal[15]以火鸡疱疹病毒为载体利用BAC构建表达H7N1病毒HA基因的重组病毒，Tang等[30]用HVT为载体构建了表达IBDV病毒VP2基因的重组病毒。相似地，它们都选择UL45/UL46作为插入位点，经检测，病毒生长曲线与亲本株相比基本上没有差异。Zhang等[31]比较重组病毒载体rMDV不同位点的转录活性，将H9N2禽流感病毒血凝素基因插入MDV的4个不同区域，插入区域包括MDV基因组中3个自身位点(US2、US10和Meq基因之一)和BAC载体中的外源位点(gpt基因)，研究发现US2区域中的HA表达盒显示出最高的活性，Meq与US10的表达活性相似，表达盒在外源区gpt基因中具有最低的活性。Andoh等[14]将IBDV的VP2基因分别插入到HVT基因组中UL3-4、UL22-23、UL45-46和US10-SORF3四个位点。研究发现4株重组病毒在体外表现出的生长活性由高到低依次为rHVT/IBD(US10)>rHVT/IBD(UL22/23)>rHVT/IBD(UL3/4)>rHVT/IBD(UL45/46)。在进行体内试验时，针对IBDV的中和抗体水平rHVT/IBD(UL3/4)株最高。综合体内与体外试验，rHVT/IBD(UL3/4)最适合作为候选疫苗。这与前面所述[15,30]插入位点为UL45-46的两株重组病毒相比，并没有产生相似的体外生长曲线，可能因为选用的启动子为鸡 β-actin 启动子，而前所述选用的是pec 启动子。Li等[32]构建针对IBDV的VP2基因的重组病毒，使用Pec启动子比使用CMV启动子的rMDV-VP2重组病毒在鸡中表现出更高的VP2表达和更强的抗IBDV的抗体应答。除此之外，Ma等[33]对比5种启动子在MDV重组病毒中的转录活性发现，外源启动子CMV的重组病毒具有更高的转录活性；但在体内试验中，具有最低转录活性启动子ppp38重组病毒针对H9N2攻击提供50%保护，内源启动子gB重组病毒诱导针对H9N2攻击提供25%保护，而对外源启动子CMV和SV40、1.8 kb内源启动子均未提供保护。Cui等[34]比较rMDV-HA和rHVT-HA针对H5N1的高致病性禽流感(HPAIV)和致死性MDV-1菌株814的保护性免疫力研究，表明用rMDV-HA接种鸡可诱导产生80%的HPAIV保护，优于rHVT-HA的保护率(66.7%)。在动物攻毒试验中，用rMDV-HA免疫的鸡可被完全保护免受强毒性MDV株J-1攻击，而rHVT-HA仅诱导80%的保护。目前，已经有一种针对IBDV的HVT-VP2商品化重组疫苗在某些养鸡场使用[35]，其具有完整的保护效力和针对IBDV的终生免疫。家禽痘病毒中，携带ILTV包膜糖蛋白gB与UL34基因的重组疫苗、HVT载体携带ILTV包膜糖蛋白gI与gD基因的活疫苗，已经可以进行商业购买[36]，这些疫苗并没有返毒能力。同种疫苗对不同物种的免疫水平也可能存在差异，Palya等[37]评估重组禽流感病毒rHVT-AI能否在不同品种鸭与鹅的体内进行复制，发现不同水生鸟类物种之间检测到重组病毒的复制率存在显著差异。构建两种血清型的重组马立克氏病毒效果评价如表1所示。

表1 重组鸡马立克氏病毒载体活疫苗Table 1 Recombinant Marek’s virus vectored live vaccine

4.2 以ILTV病毒为载体的重组病毒活疫苗

ILTV通过多次减毒鸡胚源培养(CEO)或组织培养(TCO)弱毒疫苗来预防，但这类疫苗具有残存毒力，使鸡产生潜伏性感染。目前把ILTV的糖蛋白VP2基因插入鸡痘病毒、火鸡疱疹病毒和新城疫病毒的研究较多。Pavlova等[16]构建了缺失UL50基因的传染性喉气管炎病毒，并大量表达H5N1型高致病性禽流感病(HPAIV)的血凝素(HA)基因的重组病毒ILTV-△UL50IH5V，在6周龄的鸡中评估了这种载体疫苗针对不同H5HPAIV的保护效果。结果显示，单次滴眼免疫后，所有动物均产生HA特异性抗体。H5N1病毒攻击后未观察到临床症状，只有20%的H5N2攻击动物出现最小的临床症状。

4.3 以鸭肠炎病毒为载体的重组病毒活疫苗

比较常用的鸭肠炎病毒弱毒疫苗株以DEV C-KCE和Vac为主(表2)，在对禽流感病毒的研究中，使用MAGIC技术，将血凝素H5N1病毒基因插入DEV的C-KCE基因组中的gB和UL26[20]，用于产生疫苗株pBAC-C-KCE-HA，这种疫苗提供了针对H5N1 AIV和DEV的快速免疫保护。Liu等[18]利用Fosmid多片段拯救系统构建了两组重组病毒rDEV-UL41HA和rDEV-US78HA，研究表明这两组疫苗能提供针对DEV和H5N1 AIV的保护，单剂量106PFU的rDEV-US78HA可以完全保护致死性H5N1的攻击，rDEV-US78HA比rDEV-UL41HA效果更好。该团队又利用rDEV-RE6(rDEV-US78HA)重新对SPF鸡进行评估，结果显示rDEV-RE6提供免疫原性，并对致命性H5N1 AIV提供良好保护。在坦布苏病毒(DTMUV)多价苗研究中，Zou等[17]首次利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑策略生成了DEV的 C-KCE-HA/PrM-E三价疫苗，用C-KCE-HA/PrM-E免疫的鸭子增强了针对H5N1和DTMUV体液和细胞的免疫反应。重要的是，单剂量的C-KCE-HA/PrM-E赋予了针对AIV H5N1、DTMUV和DEV的保护。此外，该团队还利用BAC和MAGIC技术构建了重组病毒C-KCE-E，证明了坦布苏病毒E蛋白在C-KCE-E感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)中强烈表达，诱导免疫鸭产生针对DTMUV的中和抗体。Chen等[38]利用Fosmid多片段拯救系统构建了两组重组病毒rDEV-TE(鸭坦布苏病毒包膜糖蛋白TE截短形式)和rDEV-PrM/TE(表达TE和前膜蛋白)。动物试验研究证明,两种重组病毒在鸭中诱导可测到的坦布苏病毒中和抗体。两次免疫后，rDEV-PrM/TE完全保护了鸭子针对坦布苏病毒的攻毒保护，而rDEV-TE仅授予部分保护。除此之外，DEV也用于生产rDEV-N、rDEV-S和rDEV-S1表达传染性支气管炎病毒(IBV)的N、S和/或S1蛋白的重组疫苗[24]。接种rDEV-N和rDEV-S1共价疫苗比使用任何单一rDEV更有效，结果显示CD4+/ CD8+淋巴细胞比率降低、病毒脱落降低和鸡死亡率降低。鸭肝炎病毒1型(DHAV-1)和3型(DHAV-3)在鸭养殖业中造成重大经济损失，但是目前还没有同时控制两种病原体的商业疫苗。Zou等[25]构建鸭肠炎病毒重组疫苗rC-KCE-2VP1，含有来自鸭肝炎病毒1型和3型的VP1，在两种不同类型的VP1之间插入一个口蹄疫病毒FMDV的自切割2A元件。动物试验结果证明，在注入单剂量rC-KCE-2VP1疫苗后，能使鸭产生有效的体液和细胞免疫反应，并完全预防致病性DHAV-1和DHAV-3菌株的挑战。

5 展望

目前，我国畜禽养殖业使用传统禽用疫苗比重最高，因传统疫苗个体小、养殖周期短、病毒种类和血清型多、变异快，新研制出的疫苗滞后于病毒变异血清型的出现。因此，构建突发性重大疾病应急反应生物制剂研究平台，并制备相应制品，需要前瞻性布局[41]。病毒活载体疫苗目前处于研究阶段，未来禽病毒疫苗的发展趋势仍以筛选安全的病毒载体为基础，实现针对外源基因的靶向性，同时降低疫苗的生产成本。因此，构建稳定的病毒活载体疫苗体系是研发活载体疫苗的重中之重。随着水禽养殖业的规模化发展，新型活载体疫苗技术需要与生产相结合，从而为防控突发性疾病提供有效的生物制剂。细菌人工染色体技术、fosmid基因文库和CRISPR/Cas9等基因编辑技术为制备高效多价疫苗提供高效的技术平台。同时，不同种类的新型疫苗可以通过技术手段进行交叉免疫组合使用，能生产出更高效、快速的多价活载体疫苗。

表2 重组鸭肠炎病毒载体活疫苗Table 2 Recombinant duck enteritis virus vectored live vaccine